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肺结节是胸部影像的一种表现，临床检出率较高，部分结节可为恶性，是肺癌的早期雏形。肺癌对人类生命健康危害极大，是全球癌症死亡的首位原因[1-2]，居我国恶性肿瘤死亡和发病的首位[3]，由于难以实现大规模肺癌早期筛查，多数患者在临床确诊时病程已至晚期，丧失了最佳治疗机会[4]。因此，世界卫生组织（WHO）提出早诊、早治是控制肺癌等癌症死亡率的有效手段[5]。就肺癌而言，肺结节的及时发现及性质判断至关重要，然而在临床工作中并不容易实现。肺结节具有起病隐匿、生长缓慢、缺少症状、病灶体积小或密度淡、早期影像特点不突出、生化检查阴性、活检不易定位等特点，均给临床诊断带来诸多困难及不确定性。目前常用的肺结节诊断手段包括：胸部CT、功能显像、肿瘤标志物等[6]，但也很难在较短时间内明确结节性质，往往需要对患者进行定期随访及动态观察。随访时间可长达5年，患者在随访及观察过程中易产生恐慌情绪或者忽略心态，甚至随访中可出现结节突然增大、恶化等后果，故积极探索新的肺结节诊断评估方法势在必行。近年来，随着分子遗传学检测技术的快速发展，肿瘤生物标志物的基因测试崭露头角，对肿瘤的诊断、治疗和预后评估有较高灵敏度和特异性[7]，而不同基因组合的甲基化检测也逐渐应用到肺结节诊断、肺癌早期筛查当中，具有一定的临床价值[8]。现采用矮小同源盒基因2（short stature homeobox 2，SHOX2）和Ras 相关区域家族1A（Ras association domain family 1 A，RASSF1A）基因组合甲基化检测参与诊断肺结节一例，报道如下。

1 病例资料

患者栗某，男，57 岁，既往体健，吸烟指数为600，因“左侧胸痛6 d”于2019年11月12日就诊于河南中医药大学第三附属医院肺病科，查胸部CT 平扫显示：左肺门区结节（图1），考虑肿瘤性病变可能。增强胸部CT 显示：结节不均匀强化（图2），肿瘤性病变不排除。

血常规、C 反应蛋白（CRP）、红细胞沉降率、肿瘤标志物等均正常。2019年11月14日行纤维支气管镜检查，镜下见左肺上叶尖后段管口轻度外压性狭窄，管腔黏膜充血水肿，依据胸部CT 及镜下表现于左肺上叶留取支气管肺泡灌洗液，于左肺上叶尖后段外支行盲检及刷检，所得标本分别送病原学、细胞学、组织学及SHOX2和RASSF1A基因组合甲基化检测。

检查结果显示：左肺上叶灌洗液涂片未查到抗酸杆菌、真菌，培养48 h 无细菌生长。左肺上叶刷片细胞学发现少量拥挤细胞团，内有异型细胞，不除外肿瘤细胞，由于细胞量少不足以诊断。左肺上叶尖后段外支盲检病理结果为肺组织慢性炎，偶见极小灶肺泡上皮异型增生，请结合临床。石蜡切片SHOX2和RASSF1A基因组合甲基化检测均为阴性。

为进一步明确诊断，患者转院至河南省肿瘤医院，于2019年12月4日在静吸复合全麻下行胸腔镜左肺上叶切除及系统淋巴结清扫术，术后病理显示：（左肺上叶）神经内分泌肿瘤，符合类癌，未累及被膜，肿物大小约2.5 cm×2.5 cm×1 cm，未见肯定的脉管内癌栓及神经侵犯。

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图1 患者胸部CT 平扫结果

图2 患者胸部增强CT 结果

2 讨论

基因甲基化是一种共价化学修饰，虽不造成DNA序列变化，但可使DNA 稳定性、蛋白质与DNA 相互作用方式及染色质结构发生变化[9]。基因甲基化在所有肿瘤中都有发生，已成为肿瘤诊断的可靠靶标[10]，研究发现，在肺癌早期诊断中，SHOX2、RASSF1A 基因具有高度敏感性和特异性[11]，对收集到的肺组织、痰液、支气管灌洗液、胸腔积液等进行基因甲基化检测，可发现早期肺癌。SHOX2 基因在多种实体肿瘤中表达异常，如肺癌，乳腺癌和肾癌[10，12-13]，而且它们能较好地对肺部良性疾病和恶性肿瘤进行鉴别诊断[14-15]，甲基化的SHOX2 不仅可作为非小细胞肺癌早期检测的生物指标，还可作为其预后判断的独立预测指标[16]。RASSF1A 基因是一种新型肿瘤抑制基因，在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用，此基因表达失活主要与启动子区异常的高甲基化、杂合性缺失及染色体缺失有关，抑癌基因的过甲基化可为肺癌诊断提供帮助[17]。

本文病例采用SHOX2和RASSF1A基因组合甲基化检测对肺结节进行诊断，诊断结果与手术病理检查结果不一致，为假阴性。分析原因可能如下：

2.1 标本类型选择不到位

采用基因甲基化检测的标本来源存在多样化的特点，如支气管肺泡灌洗液、活（盲）检组织、胸腔积液、痰液、血浆等，它们各具优劣势。以痰液标本为例，长期大量吸烟群体属肺癌高发群体，并且痰液分泌量较多，无需特殊诱导即可获得标本，所以痰液标本基因甲基化检测比较适合长期大量吸烟群体的肺癌初筛。但是痰液检测同样存在部分局限性，痰液主要来自于支气管系统靠近中央的部位，痰液检测结果难以准确显示肺外周部位的相关情况，因而对于外周部位肺癌的检测能力非常有限[18]。分析本文1例患者，虽然胸部CT 提示结节位置靠近肺门，类似中央型病变，但支气管镜下见左肺上叶尖后段管口轻度外压性狭窄，提示病灶位于管腔以外，活检钳不能直接到达病灶部位及周围，通过钳取组织的方法难以取得满意标本。若采用支气管肺泡灌洗液作为标本也许更为合适。支气管肺泡灌洗液通过先冲刷再回收的方式，能收集较广泛区域的标本，此种方式不但适合于中央型病变，还可用于周围型病变的诊断。本文1例患者若采用支气管肺泡灌洗进行标本取样，其检测阳性率可能会有所增加。

2.2 标本量采集不充足

本文1例病例气管镜左肺上叶刷片细胞学发现少量拥挤细胞团，内有异型细胞，不排除肿瘤细胞，然而，由于细胞量较少，不足以诊断。活（盲）检为有创操作，可能造成出血、气胸等并发症，盲检风险更甚，而之后的刷检也可能加重创面出血，因此，操作者在进行活（盲）检及刷检操作时往往由于担心患者出现并发症而限制操作次数及深度，继而导致标本采集量不足。相比之下，支气管肺泡灌洗液可先后两次用50 mL 37°C 灭菌生理盐水冲刷，并进行回收，冲刷范围深广，灌洗液回收量充足，极大地提高了诊断阳性率。

2.3 SHOX2和RASSF1A基因组合甲基化阳性率与肺癌病理类型有关

可做甲基化检测的基因有多种，不同的基因甲基化阳性率与肺癌病理类型之间存在相关性。Schmidt等[19]通过差异性甲基化杂交技术对肺癌患者支气管肺泡灌洗液中的癌细胞进行全基因组合分析，发现SHOX2 甲基化对诊断肺鳞癌和肺小细胞癌敏感性较高，分别为82%和97%。有研究显示[20]，SHOX2和RASSF1A基因组合甲基化检测在肺鳞癌和肺小细胞癌中的检测阳性率分别是90.9%和100%，上述情况可能与这两种类型的肺癌存在较高水平的SHOX2 基因甲基化有关。本文1例患者的病理检查结果为类癌，虽然类癌与肺小细胞癌同属于神经内分泌肿瘤，但两者之间并不完全相同，不排除存在SHOX2和RASSF1A基因组合甲基化检测对类癌阳性率不高的可能性。类癌与肺小细胞癌是否存在基因甲基化位点的不同，尚有待进一步验证。

2.4 SHOX2和RASSF1A基因组合甲基化阳性率与肺癌分化程度有关

有研究显示[12]，支气管肺泡灌洗液SHOX2和RASSF1A基因组合甲基化检测对Ⅰ期肺癌的诊断敏感性为75%，而在Ⅳ期肺癌则为100%。这可能与Ⅳ期肺癌恶性程度高、细胞分化程度低、生长速度快、更容易坏死、侵袭性更强，进而导致更多的基因释放相关。类癌细胞分化程度好，生长较为缓慢，恶性程度较低，因此SHOX2和RASSF1A基因组合甲基化可能对类癌敏感性不高，从而影响检测结果的阳性率。

3 小结

分子遗传学检测技术的快速发展为肿瘤临床诊断、治疗评估指引了新的方向，其中基因甲基化检测更是展露锋芒。临床上，SHOX2和RASSF1A基因组合的甲基化检测，对早期肺癌具有敏感性和特异性，可在肺癌的早诊早治中得以应用。但同时需关注以下几点：①需综合考虑患者情况、病变部位、影像表现等，选择恰当的标本采集方法，保证标本类型合适，标本量充足，以改善患者检测结果阳性率。②重视对病理类型和分化程度的提前估测，SHOX2 和RASSF1A基因组合的甲基化检测可能受病理类型及分化程度的影响较明显，在检测前预估有助于保证最终检测结果的准确性。

本文通过对1例肺结节假阴性案例进行分析报道，总结了其出现的可能原因，以期增强对SHOX2和RASSF1A基因组合甲基化检测的认识，从而更好地为肺癌临床诊断服务。

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