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种植牙已广泛应用于缺牙的修复，而牙周炎、慢性根尖周炎及囊肿等疾病常造成牙槽骨的吸收破坏，导致缺牙区骨宽度和高度的不足。临床上常用自体骨、骨移植材料结合胶原膜行引导骨再生术恢复缺牙区的骨量不足[1]。但这些方法的缺点是术后反应较大、完全成骨时间较长，自体骨供区受限，供区不适感等问题[2]。因此一些富含生长因子的血小板浓缩物用于临床以减少创伤、促进组织愈合。较早应用的是富血小板血浆，富血小板纤维蛋白（plateletrich fibrin，PRF）是第二代血小板浓缩物[3-4]。据报道，PRF 在牙槽脊保存术、上颌窦提升术及即刻种植等方面有促进骨愈合作用[5-7]，但单一PRF 在骨缺损的引导骨再生术中的作用尚报道较少[8]。本研究拟通过制备动物骨缺损模型，观察PRF 在骨缺损愈合中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用健康雄性山羊6 只，9～12月龄，体重19～25 kg。实验动物预饲养2周，保持羊舍通风卫生。

1.2 主要仪器与材料、试剂

1.2.1 主要仪器新康80-1 医用离心机（江苏新康医疗）；5 mL 采血试管（江苏新康）；W&H种植机（奥地利W&H 公司）；灭菌手术器械包（手术刀柄、骨膜剥离器、环形取骨钻、持针器、拉勾、挖勺、镊子、剪刀）；奥林巴斯光学显微镜（日本）；HPIAS-2000H 彩色病理图文分析系统（武汉千屏）。

1.2.2 主要材料、试剂海奥口腔修复膜（B型1.5 mm×2 mm，烟台正海生物技术公司）、克林霉素磷酸酯注射液（华北制药，规格：2 mL/0.3 g）。

1.3 实验分组及处理

1.3.1 实验分组在实验动物的下颌骨左右侧各制备三个缺损。三个缺损采用不同的处理，分别为实验组、修复膜组、空白组。分为三个时间段（术后4、8 和12周）观察实验结果。每个时间段各处理组的实验动物为2只。

1.3.2 实验处理术前禁食12 h，用3%戊巴比妥钠麻醉。在耳缘静脉采血5 mL，将采血管放入离心机离心10 min（3000 r/min）。离心结束后取出试管并观察试管内血液是否凝固形成纤维蛋白凝胶。如制取失败，则重新取血制备。2%碘伏消毒术区、铺巾，在羊的右侧下颌从尖牙远中向后做一切口。翻瓣露出下颌骨壁，注意勿伤及颏神经束。在冷冻0.9%氯化钠溶液冷却下，用取骨钻制备3个直径6 mm、厚约2 mm 的圆形缺损。从采血管取出纤维蛋白凝胶置于无菌纱布上，轻压并修剪成约1 mm 厚、长宽约16 mm×8 mm大小的PRF 膜。将PRF 膜放置实验组缺损区，修复膜组缺损区放置海奥修复膜，空白组缺损区不放置充填物。将黏膜瓣复位缝合。以同法在左侧制备三个缺损，采取与对侧相同处理。术后肌注克林霉素0.9 g/d，2%碘伏液轻拭术区，连用4 d。在2 周内完成所有动物实验，并记录手术时间。为保证实验的一致性，手术的主操作者为同一人。

1.4 观察指标

在术后4周处死2 只实验动物，制取术区标本，大体观察术区愈合情况。以各组术区为中心用骨锯截取8 mm×8 mm×3 mm 的小骨块；将骨块标本送病理室制作HE 切片，显微镜下观察切片成骨细胞及骨小梁的形态和大小。在100 倍放大率下，在每个标本不同部位采集5个图像（各处理组的样本量为2×2×5），用彩色病理图文软件测量每幅图像面积和图像内的骨小梁面积，并计算骨小梁面积百分比（骨小梁面积/图像面积）。同样，术后8 周处死2 只实验动物，进行上述指标观察；术后12 周再处死2 只实验动物，进行上述指标观察。

1.5 统计学方法

采用SPSS 14.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（

±s）表示，多组间进行方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察

实验动物无死亡，创口无感染，软组织形态正常。骨面愈合情况如下。4周：实验组与修复膜组骨缺损区中间略有凹陷；空白组凹陷较大。8周：实验组与修复膜组缺失区骨面基本长齐，但表面有颗粒感；空白组缺损区未长平。12周：三组骨缺损区已基本长平，差别不明显。

2.2 组织学观察

在100×显微镜下观察，结果见图1（封四）。4周：实验组缺损区可见新生骨小梁，其表面有类骨质和成骨细胞，成骨细胞成排排列，结缔组织内细胞多；修复膜组骨小梁、成骨细胞与实验组相似；空白组骨小梁形成较少，排列稀疏，结缔组织丰富。8周：实验组可见大片的骨小梁，骨细胞丰富，结缔组织较少，胶原纤维较多；修复膜组骨小梁增多，交织成网，骨小梁内骨细胞丰富，结缔组织较少；空白组骨小梁相对纤细，骨细胞少见，纤维结缔组织较多。12周：实验组骨小梁增厚增多，交织成网，骨胶原纤维排列整齐，骨细胞丰富，胶原纤维较少；修复膜组骨小梁增多，相互交织，骨胶原纤维增多，纤维成分较少；空白组骨小梁交织成网，纤维结缔组织较多。

图1 术后4、8 及12 周时不同处理组标本显微镜下图像（HE，100×）

A：术后4周实验组；B：术后4周修复膜组；C 术后4周空白组；D：术后8 周实验组；E：术后8 周修复膜组；F：术后8 周空白组；G：术后12 周实验组；H：术后12 周修复膜组；I：术后12 周空白组

2.3 骨计量学分析

三组在术后4、8 和12 周时骨小梁面积及其百分比的均值见表1。骨计量学分析结果显示，在术后4、8 和12周，实验组和修复膜组骨小梁面积百分比均高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；而实验组和修复膜组的骨小梁面积百分比比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

一般动物实验时应考虑以下几个方面[9]：有较好的可重复性；与研究对象比较相似；拟研究的内容在动物模型上得到较好的反映；符合动物医学伦理原则。本实验采用山羊作为实验动物，是考虑到羊性情温顺，方便麻醉和手术。羊作为较大体型动物，其组织结构和人类较为近似。为研究PRF 的成骨效果，本实验在羊的下颌骨制备骨缺损放置PRF 作为实验组，并设置了一个修复膜组和一个空白组作为对照。修复膜组用海奥口腔修复膜覆盖缺损区，隔离纤维结缔组织，引导骨再生。空白组骨缺损区不放置充填材料。

表1 三组在术后4、8 和12 周时的骨小梁面积及百分比的比较＊

*：每幅图像面积均为34 cm2

本实验结果显示，在术后4、8 及12 周三个时间段实验组和修复膜组骨缺损区成骨活跃、骨小梁面积和百分比都较空白组好，差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组和修复膜组骨小梁面积百分比比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。提示PRF 有较好的促进成骨作用，与口腔修复膜的成骨效果相似。空白组的成骨效果较差，表明本实验较好地排除了机体自愈能力造成的干扰。付冬梅等[10]在用比格犬观察PRF 成骨效果的实验中，实验组用PRF 置入骨缺损，对照组设置自体骨+胶原膜组及Bioss 骨粉+胶原膜组，发现在3、6个月时实验组较两个对照组的成骨效果更优。蒋思静等[11]发现运用自体髂骨骨松质联合PRF 修复牙槽嵴裂的效果较单用自体骨的效果好。上述研究与本实验结论较为一致。

海奥口腔修复膜是异种脱细胞真皮基质，是皮肤组织经物理、化学的方法去除细胞成分，保留细胞外基质而形成，主要成分为Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维[12]。作为一种可吸收屏障膜，口腔修复膜引导骨再生的效果较为可靠，但在临床使用中也有一定的缺点，存在膜暴露感染、膜塌陷移位、抗原性风险及术后肿胀反应较明显等问题[13]。

血小板浓缩物由于含有多种生长因子而被用来促进组织愈合，改善术后反应。应用较早的是富血小板血浆，其制备过程需加入抗凝剂和凝血酶[3]。PRF 是Dohan 等[14]报道的一种新一代血液浓缩物。PRF 的优点是富含纤维蛋白、血小板生长因子及白细胞；制备简单，只需一次离心就可完成；不含抗凝剂和凝血酶等生物制剂。有研究表明PRF 能促进成骨相关细胞的分化和增殖，如Dohan Ehrenfest 等[15]认为PRF 通过促进骨髓干细胞的增殖，提高成骨细胞蛋白激酶和骨保护素的表达，从而促进成骨细胞的生长。杨颖等[16]通过实验认为PRF 混合自体骨髓浓缩物可显著加快新骨再生的速度。

研究认为PRF 的生物学作用与其富集的多种生长因子、白细胞及其三维空间结构有关[17]。PRF 富含的生长因子有转化生长因子-β（TGF-β）、血小板衍生因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）及胰岛素样生长因子（IGF）等[18]。TGF-β 可促进成骨细胞前体趋化及有丝分裂、刺激成骨细胞沉积于骨胶原基质中；PDGF 可促进间充质细胞迁移、增殖及分化；VEGF 可促进组织血管生成；IGF 能促进间充质细胞的增殖。PRF 中的白细胞可释放细胞因子白介素-1β（IL-1β）、IL-4、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等[19]。这些细胞因子有调节免疫、抵抗感染，促进组织愈合的作用。PRF 中的纤维蛋白在生理性聚合过程中相互交织，形成坚韧微孔的三维空间结构[20]。这种结构有利于缓慢释放其中的生长因子，并可作为细胞迁移、增殖分化的支架。报道显示，PRF 生长因子的释放7～14 d 达到高峰[21]，而PRP 生长因子的释放第1 天就达到高峰。罗晓丁等[22]通过免疫组化的方法检测到PRF 中IL-1β、IL-4、IL-6、TNF、PDGF BB、TGF-β1 呈阳性表达，认为这些因子与纤维蛋白共同作用使PRF 具有降低感染和促进组织愈合的作用。

综上所述，PRF 有较好的促进骨愈合作用。相比于修复膜，PRF 来源于自身血液，生物相容性好，组织反应较轻，抗感染能力好，制备简单，因此有较好的应用前景。但由于本实验为动物实验，PRF 的实际效果还有待于进一步研究。

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