系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）属于自身免疫性疾病，患者多伴有发热、关节疼痛、蝶形红斑等症状，若未得到及时治疗，可能会累及多个系统，引起多种并发症[1-2]。SLE 疾病活动指数（SLE disease activity index，SLEDAI）为临床评估 SLE 患者病情严重程度的常用方法， 可将SLE 分为活动期与缓解期，但SLEDAI 容易受评估人主观意识影响，且评估内容较多， 导致其在临床中应用存在一定局限性。而临床对于不同病情的SLE 患者其治疗方法也不尽相同，缓解期患者经临床积极治疗后预后良好，病情容易控制，但活动期患者临床治疗难度较高，且病情复杂，极易引发狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN），严重损伤肾脏功能，影响疾病预后[3-4]。因此，采取有效的手段积极评估SLE 患者病情具有重要意义。 程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）、程序性死亡配体-2（programmed death ligand-2，PD-L2）均为程序性死亡受体1（programmed death receptor 1，PD-1）的配体，研究指出，PD-1 与其配体组成的信号途径具有负调节免疫反应作用，且在免疫活化与耐受中具有重要作用[5]。 以往，临床对PD-1 的配体PD-L1关注度较高，而有关PD-1 的另一个配体PD-L2 关注度较低。 基于此，本研究旨在分析外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的 PD-L2 分子在SLE 中的应用价值。

回顾性分析 2019 年 1 月至 2020 年 1 月萍乡市人民医院收治的 30 例 SLE 患者临床资料，将SLEDAI[6]评分＞5 分的15 例活动期狼疮性肾炎患者纳入活动期组，将SLEDAI 评分≤5 分的15 例缓解期狼疮患者纳入缓解期组，并选取同期于萍乡市人民医院接受治疗的10 例类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者作为活动期阳性对照病例纳入RA 组及接受体检的10 例健康志愿者纳入正常对照组。 活动期组中，男 3 例，女 12 例；年龄 46~74 岁，平均（58.69±2.36）岁；病程 2~6 个月，平均（4.04±0.52）个月；体重指数（body mass index，BMI） 21~27 kg/m2，平均（22.89±1.25）kg/m2。 缓解期组中，男 5 例，女 10 例；年龄 46~75 岁，平均（58.73±2.08）岁；病程 2~6 个月，平均（4.02±0.55） 个月；BMI I21~27 kg/m2， 平均 （22.92±1.19）kg/m2。RA 组中，男 4 例，女 6 例；年龄 44~72 岁，平均（58.91±2.15）岁；病程 1~5 个月，平均（4.03±0.32）个月；BMI 22~27 kg/m2，平均（23.10±1.06）kg/m2。 正常对照组中，男 6 例，女 4 例；年龄 45~73 岁，平均（59.02±2.10）岁；BMI 21~27kg/m2，平均（22.96±1.20）kg/m2。 纳入标准：①患者符合《系统性红斑狼疮诊断及治疗指南》[7]内相关诊断标准，LN：尿蛋白定量＞0.5 g/d；②年龄18~75 岁者；③活动期组患者未用过激素和免疫抑制剂或停药后复发。 排除标准：①妊娠期或哺乳期妇女；②伴有其他系统性结缔组织病者；③合并肿瘤性疾病者。 四组患者性别、年龄、BMI 比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。 本研究经萍乡市人民医院医学伦理委员会批准。

PBMC 的PD-L2 分子表达水平检测：①实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，Real-time PCR） 检测 PDL2 分子表达水平方法如下： 应用淋巴细胞分层液（Ficoll）梯度分离 PBMC，使用 TRIzol 抽提 PBMC 中总 RNA（TaKaRa，大连），Oligo-dT 反转录为 cDNA 后置于-20oC 下备用。 内参引物为 β-actin，序列为：正向 5′-ATCTGCCACCACACCTTCTACC-3′； 反向 5′-GATAGCACAGCCTGGATAGCAA3′。 PD-L2 引物序列为：正向 5′-GTCAGATGGAACCCAGGACC-3′；反向5′-TAGGCTCCAGAGGTGAGTCC-3′。 Real-time PCR使用德国QIGEN 公司提供的SYBR，采用PCR 两步法进行试验，具体为 60℃、30 s，90℃、10 s，45 个循环，结果应用循环阈值（cycle threshold，CT）表示，基因表达量为目的基因PD-L2 的CT 值-内参引物CT 值得到的△CT。 ②流式细胞术检测PD-L2 分子表达水平方法如下： 使用流式细胞术评估外周血T 细胞、B 细胞与PBMC 中 PD-L2 的表达。 使用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline solution，PBS） 对方法①中得到的PBMC 进行洗涤， 并制成1×106 单细胞悬液，提取50 μl 单细胞混悬液与3 μl 德国美天旎公司提供的异硫氰酸荧光素标记CD14 抗体及美国BD 公司提供的抗原呈递细胞标记PD-L2 抗体共孕0.5 h，经PBS 洗涤后避光保存待检，使用美国BD 公司提供的Accuri C6 型流式细胞仪进行检测。

记录患者PD-L2 分子表达水平、比较各组PD-L2分子表达水平、分析SLEDAI 评分与PD-L2 分子表达水平的相关性、 及PD-L2 分子对SLE 患者病情活动程度的预测价值。 ①记录不同性别、年龄、体重患者PD-L2 分子表达水平。 ②比较四组患者PD-L2 分子表达水平。 ③分析SLE 患者SLEDAI 评分与PD-L2分子表达水平的相关性。 ④分析PD-L2 分子表达水平对SLE 患者病情活动程度的预测价值。

采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析， 计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t 检验；计数资料用率表示， 组间比较采用 χ2 检验；SLEDAI 评分与PD-L2 分子表达水平的相关性分析采用Pearson 相关性检验；绘制受试者工作曲线（receiver operating curve，ROC），得到曲线下面积（area under the curve，AUC），分析PD-L2 分子表达水平对SLE 患者病情严重程度的预测价值，以P＜0.05 为差异存在统计学意义。

不同性别、年龄、体重的SLE 患者PD-L2 分子表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表 1）。

表1 不同性别、年龄、体重SLE 患者PD-L2 分子表达水平的比较（）

活动期组PD-L2 分子表达水平高于缓解期组与正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；活动期组PD-L2 分子表达水平与RA 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表 2）。

表2 四组患者PD-L2 分子表达水平的比较（%，）

 

与活动期比较，aP＜0.05

活动期组患者 SLEDAI 评分为（8.45±2.13）分，缓解期组患者 SLEDAI 评分为（3.01±0.54）分。 经 Pearson 相关性分析发现，SLE 患者SLEDAI 评分与 PDL2 分子表达水平呈正相关（r=0.946，P=0.000）。

将SLE 患者病情活动程度作为状态变量（1=活动期，0=缓解期）， 将PD-L2 分子表达水平作为检验变量，绘制 ROC 曲线（图 1），结果显示，PD-L2 分子表达水平预测SLE 患者处于活动期的 AUC 为0.820，AUC 的 95%置信区间为 0.662~0.978， 标准误为0.081，P 值为 0.003，最佳阈值为12.17%，灵敏度为0.800，特异度为0.800，约登指数为0.600，具有较高的预测价值。

 

图1 PD-L2 分子表达水平对SLE 患者病情活动程度的预测价值的ROC 曲线图

SLE 发生后可能会累及肾脏、血液、呼吸道、淋巴等脏器与系统，以肾脏损伤最为常见，且该疾病发生与发展均与免疫功能紊乱有关，并且免疫功能情况与疾病活动情况及器官损伤具有密切联系[8]。 而PBMC的PD-L2 分子表达与免疫功能有关[9]。

已有大量研究显示，SLE 患者 PBMC 中 PD-1、PD-L1 表达异常，且提出PD-1 受体表达降低会严重影响机体免疫耐受功能， 进而生成大量自身抗体，而关于PD-1 另一个配体PD-L2 在SLE 患者中的生物学功能机制尚未明确[10-12]。本研究结果显示，活动期组PD-L2 分子表达水平高于缓解期组与正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；活动期组 PD-L2 分子表达水平与 RA 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 经Pearson 相关性分析发现，SLE 患者 SLEDAI 评分与PD-L2 分子表达水平呈正相关（r=0.946，P=0.000），提示PBMC 的PD-L2 分子表达水平可能与SLE 患者病情活动程度存在一定关联，且表现为正相关。 分析其原因为，PD-1/PD-L 为CD28/B7 家族重要成员，可通过抑制T 细胞活化与增殖发挥调控免疫应答作用，而近年来，也有研究指出其对T 细胞活化也具有一定作用[13-14]。已有研究发现，一系列正性与负性刺激信号共同介导了T 细胞活化， 而PD-L2 分子是一种重要的负性共刺激分子，故其对T 细胞活化也可能具有一定作用[15-16]。 根据上述研究结果，本研究推测，PD-L2 分子高表达可能是SLE 患者病情严重程度的预测因子。为证实这一推测，最后绘制ROC 曲线，结果显示，PD-L2 分子表达水平预测SLE 患者处于活动期的AUC 为0.820，具有较高的预测价值，表明PD-L2 可作为SLE 患者病情严重程度的预测因子。 鉴于本研究样本量较少，若条件允许，后期工作可进一步扩大样本来以证实本研究结果，此工作可能为探索PD-L2分子生物学功能， 为研究SLE 发病机制及预后评估中提供参考依据。

综上所述，PBMC 的PD-L2 分子表达水平与SLE患者病情活动程度密切相关，临床可通过检测PBMC的PD-L2 分子表达水平及时评估SLE 患者病情状况，以制定有效的治疗方案。

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Application of peripheral blood mononuclear cell PD-L2 molecule in systemic lupus erythematosus

LIU Yu-wen LIU Ping HU Na GE Hong-liang PENG Yu-wei
Department of Rheumatology and Immunology,Pingxiang People′s Hospital,Jiangxi Province,Pingxiang 337000,China

[Abstract] Objective To investigate the application of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) programmed death ligand-2 (PD-L2) molecule in systemic lupus erythematosus (SLE). Methods The clinical data of 30 patients with SLE admitted to Pingxiang People′s Hospital from January 2019 to January 2020 were retrospectively analyzed. A total of 15 patients with lupus nephritis at active stage with SLE disease activity index (SLEDAI) score >5 points were included into the active group, a total of 15 patients with lupus at remission stage with SLEDAI score ≤5 points were included into the remission group, a total of 10 patients with rheumatoid arthritis (RA) treated in Pingxiang People′s Hospital during the same period were selected as active control cases and included in the RA group, and 10 healthy volunteers who received physical examination were included in the normal control group. All selected candidates received PD-L2 molecular detection of PBMC, the application value of PD-L2 molecule expression level of PBMC in SLE patients was analyzed. Results There was no statistical significant difference in the expression level of PD-L2 molecule in SLE patients with different gender, age and weight (P>0.05); The expression level of PD-L2 molecule of patients in the active group was higher than that in patients of the remission group and the normal control group, and the differences were statistically significant (P<0.05); there was no statistical significant difference in the expression level of PD-L2 molecule of patients between the active group and the RA group (P>0.05); Pearson correlation analysis found that SLEDAI score was positively correlated with PD-L2 molecular expression level of SLE patients (r=0.946, P=0.000); the receiver operating curve was drawn, the results showed that the area under the curve of PD-L2 molecular expression level in the prediction of SLE patients at active stage was 0.820, which had high predictive value. Conclusion The expression level of PD-L2 molecule in PBMC is closely related to the degree of disease activity in SLE patients, which can assist clinical evaluation of the severity of the disease, and provide effective reference for the formulation of clinical treatment regimen.

[Key words] Systemic lupus erythematosus; Lupus nephritis; Peripheral blood mononuclear cell programmed death ligand-2; Activity index of systemic lupus erythematosus disease

[中图分类号] R593.241

[文献标识码] A

[文章编号] 1674-4721（2021）12（a）-0079-04

[基金项目]江西省萍乡市科技计划项目（2018PY031）。

（收稿日期：2021-08-31）