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肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的肝癌组织学亚型，占全世界原发性肝癌的80%以上[1]。在全球范围内，HCC 是与癌症相关死亡的第四大最常见原因，其五年生存率仅为18%，是仅次于胰腺癌的第二大致命肿瘤[2-3]。由于大部分HCC 患者发现时已处于进展期，而全身化疗的中位生存时间也不到1 年，治疗效果不理想[4]。阿拉嘎斑布是我国的传统蒙药，是芫菁科昆虫的干燥虫体，其具有破血逐瘀、散结消癥、滋补肾阳、调理体素、增强抵抗力等功效[5]，其有效药物成分主要为斑蝥素（cantharidin，CTD），分子式C10H12O4，分子量196.2 D。有关CTD 的提取方法不尽相同，主要有震荡静置提取法、超声波震荡提取法、冷浸提取法、碱水提取法、热回流提取法等[6-9]。有文献报道，芫菁虫体不同部位的CTD 产率有差别，其中产率最高的部位为虫体的腹部，并且发现干燥虫体较活体虫体能获得更多的CTD[10]。CTD 对多种人类恶性肿瘤均表现出显著的抗癌活性，如对喉癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、皮肤癌等多种肿瘤的生长表现出明显的抑制作用[11-14]。但是，CTD 对肝癌抑制作用的具体分子机制目前仍不完全清楚。本研究选用蒙药阿拉嘎斑布虫体作为研究药物，使用课题组前期通过混合法提取的CTD 作为实验用药，研究其对HepG2 细胞的影响，并通过RNA 测序，尝试从分子水平及基因表达谱的角度对CTD 治疗肝癌的分子机制进行研究，为蒙药用于肝癌的治疗提供新的线索和依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

HepG2 细胞株购自武汉普诺赛生物科技有限公司；阿拉嘎斑布干燥虫体购自内蒙古自治区中医医院；胎牛血清购自美国GIBCO 公司；CTD 标准品及PI细胞周期检测试剂盒购自西格玛奥德里奇上海贸易有限公司；MTT 试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；Caspase-Glo R 3/7 检测试剂盒购自普洛麦格北京生物技术有限公司；RNAiso Plus Total RNA 提取试剂盒等。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养本研究所用的HepG2 细胞株，于含有10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的DMEM 完全培养液中进行培养，根据细胞生长状态，2~3 d 传代一次。

1.2.2 CTD 母液的配制将课题组前期提取的CTD 白色粉末用含1‰二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的DMEM 基础培养液进行超声溶解配制母液，使用时再用完全培养液稀释至所需浓度。

1.2.3 实验分组设置空白对照组（Blank）：不含细胞，加只含有1‰ DMSO 药物溶剂的完全培养液；溶剂对照组（Mock）：含正常目的细胞，加只含有1‰ DMSO药物溶剂的完全培养液；实验组（CTD）：含正常目的细胞，加含有相应浓度CTD 的含药培养液。

1.2.4 MTT 法检测增殖于3 块96 孔板内接种细胞，每组三个复孔，孵育24 h 后加药处理，分别于24、48、72 h 后检测光密度（optical density，OD）值。实验分为Blank 组、Mock 组和 CTD 组，其中 CTD 组的浓度分别为 0.05、0.1、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024 μmol/L。使用 Graphpad prism 5 软件进行半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）数值计算。

1.2.5 Caspase 3/7 荧光法检测凋亡于96 孔板内接种细胞，每组三个复孔，孵育48 h 后加药处理，48 h后加Caspase 3/7 反应液检测。实验分组同1.2.4。

1.2.6 流式细胞仪PI 单染法检测细胞周期于6 孔板内接种细胞，每组三个复孔，孵育24 h 后加药处理，48 h 后收集细胞，于4℃冰箱固定24 h，加入Rnase A溶液和PI 染色液后上机检测。实验分为Mock 组和CTD 组，实验重复 3 次。

1.2.7 测序技术检测差异表达的mRNA 收集足量细胞，采用Trizol 法提取总RNA 后进行建库，质检合格后，采用Illumina 测序平台进行RNA seq，随后进行差异基因筛选，并进行富集分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计学软件和GraphPad Prism 5进行数据分析，计量资料用均数±标准差（

）表示，两组间比较采用t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT 法检测结果

检测结果见图1。CTD 对HepG2 的抑制呈现一定程度的剂量-时间依赖，且 24、48、72 h 的 IC50 分别为54.420、9.892、4.132 μmol/L，48 h 对应曲线的线性效果最佳。因此，参考 48 h 的 IC50 值，将 10 μmol/L 作为后续实验的CTD 药物浓度。

图1 CTD 作用于HepG2 的剂量反应曲线

2.2 Caspase 3/7 荧光法检测结果

Caspase 3/7 荧光法检测结果见图2。结果表明，加药作用 48 h 后，MOCK 组荧光强度为 7661.67±108.87，CTD 组为 24 310.00±305.50，与 MOCK 组比较，CTD组荧光强度有明显的增强，差异有统计学意义（P＜0.01），CTD 是 HepG2 凋亡的有效诱导物。

图2 CTD 对HepG2 细胞凋亡的影响

2.3 流式细胞仪PI 单染法检测的 CTD 对HepG2 细胞周期的影响

流式细胞仪PI 单染法检测结果见图3（封三）。与MOCK 组比较，加药作用 48 h 后，G0/G1 期和 S 期下降，差异均有统计学意义（P＜0.05），而 G2/M 期则明显上升，差异有统计学意义（P＜0.01），CTD 可将 HepG2细胞周期阻滞于G2/M 期。

图3 CTD 对HepG2 细胞周期的影响

2.4 测序技术检测 CTD 对 HepG2 细胞 mRNA 差异表达谱的影响

2.4.1 差异基因筛选结果 mRNA 差异基因统计结果见图4（封四）。当差异基因筛选的阈值为|log2（Fold Change）|＞2 且 Padj＜0.05 时，mRNA 差异基因共计6293 个，其中5694 个差异表达水平升高，599 个差异表达水平下降。

2.4.2 差异基因富集分析结果差异mRNA 靶基因的GO 功能富集和KEGG 通路富集结果分别见图5~6（封四），筛选条件均为 Padj＜0.05。 GO 功能富集选择显著性最明显的一个注释，即为endoplasmic reticulum lumen（P＜0.05），属于 cellular component 类目。KEGG通路富集主要富集在p53 signaling pathway、PI3KAkt signaling pathway、Apoptosis、MicroRNAs in cancer以及多种代谢途径（P＜0.05），差异基因可能通过这些不同的功能及通路调控HepG2 细胞的生物进程。对于以上筛选出的显著差异表达mRNA，通过大量的查阅文献并结合GO 功能富集和KEGG 通路富集分析，以及按照差异基因相对表达量的变化倍数从高到低进一步筛选出mRNA 共计18 个基因，其中14 个基因表达水平上调，4 个基因表达水平下调，结果见表1，这些基因在CTD 作用于HepG2 细胞时可能发挥关键作用。

表1 显著差异表达的mRNA 基因汇总表

3 讨论

本研究将阿拉嘎斑布的有效成分CTD 选为研究药物，以HepG2 细胞为研究对象，先后从CTD 作用于HepG2 细胞后的细胞增殖、凋亡和周期分布三个角度进行了实验研究，结果显示，CTD 可显著抑制HepG2的增殖，其机制可能与诱导凋亡和触发细胞周期阻滞于G2/M 期有关。

为了进一步研究CTD 抑制肝癌的作用机制，本研究采用RNA-seq 测序技术，从mRNA 基因差异表达谱的角度研究CTD 抑制肝癌的分子机制。最终筛选出18 个显著差异表达的mRNA，这些基因参与调控多种信号通路如p53 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、p38-MAPK 信号通路等。

双特异性磷酸酶（dual specificity phosphatase,DUSP）、CDKN1A 和 CDK1 是以上筛选出的显著差异表达的mRNA。DUSP 属于酪氨酸磷酸酶中的亚家族，其在体内可参与调控多种信号途径，与肿瘤关系密切[15-16]。 DUSP1 是 DUSP 的家族成员之一，研究表明DUSP1 可通过对MAPK 信号通路进行负性调控从而对肝癌细胞的增殖进行抑制[17-19]，提示DUSP1 在肝癌中发挥的是抑癌作用，与本研究的测序结果一致，即用 CTD 处理 HepG2 细胞后，与对照组比较，CTD 组的DUSP1 mRNA 表达水平上调，可以推测DUSP1 在CTD 的抗肝癌过程中发挥重要作用。

CDKN1A，又名P21，是细胞周期依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）的抑制剂，其对细胞周期的调控具有关键作用[20-21]。研究发现，CDK1 是CDKN1A 的重要靶标，CDKN1A 通过下调CDK1 使其活性受到抑制，从而将细胞周期阻滞于G2/M 期[22]。这表明CDKN1A 和CDK1 在调控细胞周期阶段转化中起关键作用，与本研究的结果一致，即将CTD 作用于HepG2 细胞后，与对照组比较，CTD 组 HepG2 细胞被阻滞于G2/M 期，且 CTD 组的CDKN1A mRNA 表达水平上调，而CDK1 mRNA 表达水平下调，提示CDKN1A 对CDK1 的负性调控可能是CTD 将 HepG2 细胞阻滞于G2/M 期的重要环节。

以上这些基因中，一部分已经有文献报道其与肝癌或者其他肿瘤在分子机制上的关系，但绝大多数均未从CTD 的角度进行过分析研究，而本研究目前的结果已表明这些基因可能会是CTD 抑制肝癌的重要应答基因，因此这些基因将会是本研究下一步继续深入研究CTD 抑制肝癌分子机制的研究对象。

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