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双酚 A（bisphenol A，BPA）是塑料的主要成分[1]。现如今塑料越来越广泛地应用于各个领域，特别是人类日常生活用品中，甚至牙科修复和正畸等临床常规操作中所需的牙科材料中也含有BPA[2]。2003年BPA相关产品的年产量就已经达到64亿磅，且还在逐年增长[3]。焚烧塑料垃圾时BPA能快速地渗入人类周边的生态环境，例如地下水，所以人类除了从各种盛用食品的塑料用品中摄入BPA之外，环境污染进一步增加了BPA的摄入。一项荟萃分析发现，全球不同种族、不同国家的人群都受到不同程度的污染[5]。因此BPA对人体各个系统的影响引起了各个领域的高度重视，本研究以大鼠心室肌细胞及离体心脏为研究对象观察BPA是否具有促心律失常的作用，并初步探讨这一作用的电生理机制。

1 对象与方法

1.1 实验动物

选用体重200～250 g的二级清洁成年健康SD大鼠（Harlan；Indianapolis，IN）（其中雄性共 13 只，雌性共70只）作为实验对象，实验经辛辛那提大学医学伦理委员会批准，且动物实验过程中严格遵照辛辛那提大学实验动物管理委员会（Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC）的相关手册和美国兽医协会专家小组推荐的安乐死进行。

1.2 主要仪器与试剂

BPA 购自 TCI公司（批号：Cl03105ES）；M199 培养液购自Gibco公司（批号：31100-035）；Ⅱ型胶原酶及透明质酸酶购自Worthington公司；层粘连蛋白批号：114956-81-9；Fluo-4AM购自Invitrogen公司。

1.3 方法

1.3.1 成年大鼠心室肌细胞的分离与培养大鼠麻醉后处死，离体心脏经Langendorff灌注系统加入Ⅱ型胶原酶及透明质酸酶进行灌注，酶解，收集心室肌细胞。小盖玻片先用层粘连蛋白覆盖，再接种细胞悬液，将细胞置于37℃，5%二氧化碳的孵箱内生长24 h后用于实验。

1.3.2 实验分组雌性和雄性大鼠按实验要求进行分组（细胞实验部分各组至少测量3只大鼠，每只大鼠测量8～10个细胞，离体心脏部分各组至少测量8只大鼠），具体分组如下：按BPA浓度，将雌性大鼠心室肌细胞分为正常对照组（n=24）以及 10-12mol/L（n=26）、10-10mol/L（n=25）、10-9mol/L（n=27）、10-8mol/L（n=25）、10-6mol/L（n=26）共 6 组，用来记录 BPA 的剂量-效应曲线。再将雄性大鼠心室肌细胞分为正常对照组（n=25）、BPA 组（10-9mol/L，n=28）、E2组（10-9mol/L，n=25）和阳性对照组[去甲肾上腺（isoproterenol，ISO）10-8mol/L，n=24]。按实验要求雌性大鼠心室肌细胞实验部分分成正常对照组（n=24）、BPA 组（10-9mol/L，n=26），E2组（10-9mol/L，n=27）以及 BPA+E2组（BPA及E2的浓度均为10-9mol/L，n=26），同时后瞬时实验部分添加了 BPA 2X 组（n=26）和 E22X（n=27）组（两组浓度均为2×10-9mol/L）。雌性大鼠离体心脏实验分成正常对照组（n=8），BPA+E2组（BPA 及 E2的浓度均为 10-9mol/L，n=10），ISO 组（10-8mol/L，n=8）和 BPA+E2+ISO组（BPA和E2均为10-9mol/L，ISO为10-8mol/L，n=8）。

1.3.3 心室肌细胞收缩率的测量将心室肌细胞置于记录槽内。适应2 min左右，以0.5 Hz的频率刺激细胞，利用 Video-edge detection system（Crescent electronics）记录细胞收缩率，保存，利用软件clampfit 9.2对数据进行分析。

1.3.4 离体心脏心电图的测量大鼠麻醉后，迅速开胸，取出心脏，主动脉插管，悬挂于Langendorff系统上，不间断灌流，40～50 min后离体心脏的心尖部连接心电图数据线的正极，负极与主动脉插管连接，用PowerLab 4/30（AD instrument）记录正常心电图。间隔20 min后，用各组药物进行灌流20 min，再次记录心电图。用Labchart 7软件对数据进行分析。

1.3.5 心肌细胞后瞬时的测量心室肌细胞用4 μmol/L的钙离子荧光探针Fluo-4 AM 37℃避光处理6 min后置于共聚焦倒置显微镜（ZEISS，LSM 510）平台上的自制记录槽内，固定，槽内滴入Tyrode′s溶液。以2 Hz刺激细胞 12.5 s，关闭刺激器，再观察 10 s，用ZEISS LSM 510软件记录数据，统计发生后瞬时的细胞百分率。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（

±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，两组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 BPA的剂量-效应曲线

10-12mol/L BPA 组、10-10mol/L BPA 组、10-9mol/L BPA组、10-8mol/L BPA组、10-6mol/L BPA组的细胞收缩率高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图 1）。

图1 雌性大鼠心肌细胞收缩率记录示意图以及BPA的剂量-效应曲线

A：雌性大鼠心肌细胞收缩率记录示意图；B：BPA的剂量-效应曲线；与正常对照组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01

2.2 雌雄大鼠心室肌细胞收缩率的比较

BPA组、E2组的细胞收缩率高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；BPA+E2组的细胞收缩率高于正常对照组、BPA组及E2组，差异有统计学意义（P＜0.01）（图2）。雄性大鼠心肌细胞BPA组、E2组的细胞收缩率与正常对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 各组雌雄性大鼠的心肌细胞收缩率

与正常对照组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01

2.3 各组雌性大鼠心室肌细胞后瞬时百分比的比较

BPA 组、2×10-9mol/L BPA 组、E2组、2×10-9mol/L E2组的心室肌细胞后瞬时百分比高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；2×10-9mol/L BPA 组的心室肌细胞后瞬时百分比与BPA组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；2×10-9mol/L E2组的心室肌细胞后瞬时百分比与E2组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；BPA+E2组的心室肌细胞后瞬时百分比高于正常对照组、BPA组及E2组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图 3，封三）。

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图3 雌性大鼠心室肌细胞产生自发现后瞬时的示意图（见内文第6页）

箭头所指为自发性的后瞬时

2.4 雌性大鼠离体心脏室早频率的比较

BPA+E2组、ISO组的离体心脏室早频率与正常对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；ISO+BPA+E2组的离体心脏室早频率高于正常对照组、BPA+E2组及 ISO 组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图 4）。

图4 正常情况及在ISO存在时，BPA＋E2对雌性大鼠离体心脏室早频率的影响

A：心电图示意图；B：雌性大鼠离体心脏室早频率的比较；与正常对照组比较，aP＜0.05

3 讨论

目前已证实BPA是雌激素的内分泌干扰化合物。大量的研究显示BPA具有促前列腺癌细胞增殖、诱发乳腺癌、增加2型糖尿病及甲亢风险、影响生殖系统和免疫系统功能、使神经内分泌系统紊乱和改变人类行为学等一系列作用[6-11]，且通过多个信号通路发挥其毒性作用[12]。对于心血管系统，流行病学调查及动物试验显示，BPA暴露特别是低剂量BPA长期暴露时，可诱发多种心血管系统疾病，包括急性心肌梗死、各类心律失常、扩张性心肌病、动脉粥样硬化和高血压等[13]。

本研究以最简单易测的心室肌细胞收缩率作为参考值，观察BPA对大鼠心室肌细胞的作用。结果显示对于雌性大鼠心室肌细胞，无论是高浓度还是低浓度的BPA都能不同程度地增加心室肌细胞的收缩率，其中浓度为10-9mol/L的作用最强，其剂量-效应曲线呈倒“U”状。进一步观察BPA对雄性大鼠心室肌细胞收缩率的检测发现BPA对雄性大鼠心肌细胞无影响。由此可见BPA对大鼠心室肌细胞的作用具有雌性性别特异性。

延迟后除极（delayed after depolarization，DAD）是心律失常形成的主要机制之一，阵发性房颤、局灶性室速等心律失常的主要电生理机制就是DAD[14-15]，且去甲乌头碱等一些药物可能通过诱发DAD产生促心律失常作用[16]。DAD是指舒张期或细胞静息状态时胞浆内的游离钙离子增多，再通过细胞膜上的钠钙交换子将一个钙离子泵至细胞外，三个钠离子泵入细胞内，进而形成一个净内向电流，除极细胞膜，诱发一个新的动作电位，因此心肌细胞内钙动力学发生紊乱则有可能引起DAD[14，17]。有研究发现低浓度的BPA能影响胰腺β细胞及骨骼肌细胞内游离钙离子浓度[18-19]，提示BPA有可能会影响心室肌细胞内的钙动力学。因此笔者推测BPA或许能通过DAD机制发挥促心律失常作用。对于心室肌细胞，DAD可以表现为快速刺激后自发性产生的后瞬时。本研究结果显示，BPA能明显促进雌性大鼠心室肌细胞后瞬时产生。且加入生理浓度的E2和BPA共同作用与心肌细胞后，产生后瞬时的细胞百分率进一步增加。而将BPA或E2的浓度增加一倍后，并不能明显增加产生后瞬时的细胞百分数。由此可见，BPA可能通过诱发DAD发挥促心律失常作用，而且能与E2产生协同作用。

交感神经兴奋后能影响心脏电稳定性，从而恶化各种病理状态下的心脏电生理功能，诱发心律失常[20-21]，离体心脏用ISO灌注后能刺激交感神经，模拟整体心脏的应激状态。本研究关于雌性大鼠离体心脏部分的研究结果显示，BPA联合E2并不能增加雌性大鼠离体心脏室早发生频率，但这样的结论并不能代表BPA对离体心脏无促心律失常作用。利用ISO模拟应激状态，进一步观察BPA对雌性大鼠离体心脏的作用，在这一部分中，结果显示BPA+E2能明显增加雌性大鼠离体心脏的室早频率。笔者推测BPA能影响细胞水平的电生理，由于作用比较微弱，在整体心脏水平并不能产生明显的变化，但其能降低心室发生心律失常的阈值。因此在应激状态下，BPA促进心律失常的产生。本研究仅探讨BPA对雌性大鼠的促心律失常作用及这一作用的性别特异性，但造成这种性别特异性及其促心肌细胞延迟后除极产生的具体电生理及分子机制如何，对于在体雌性大鼠心脏BPA又将产生怎样的影响，还需更深入的研究去阐明。

综上所述，BPA能通过增加大鼠心室肌细胞后瞬时，产生DAD，从而促进心律失常的发生。且这一作用为雌性特异性。当存在生理浓度的E2时能进一步加强BPA的作用，而这并非单纯的作用叠加，是两者协同作用的结果。本研究初步探讨BPA对心血管系统的作用，并为临床防治环境污染所致的心血管系统疾病提供实验室依据。

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