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深静脉血栓（deep venous thrombosis，DVT）是指血液在深静脉中异常的凝结，使血管阻塞、并导致组织器官缺血缺氧坏死的一种外周血管疾病，是外科手术最为常见的并发症，并且发生率极高[1-2]。而且随着中国老年人口增加，老年人关节置换手术量的增加，DVT、肺动脉栓塞并发症发生率也迅速上升，成为威胁人类生命安全的一个重要疾病，因此对于DVT 的预防与治疗迫在眉睫[3-4]。但迄今为止，DVT 形成机理尚不明确，有报道认为静脉内皮损伤所引起的内皮细胞凋亡是DVT 形成的重要因素，因此探讨内皮细胞凋亡机制对于DVT 形成机理的阐明具有重要意义[5-6]。内质网应激（endoplasmic reticulum，ERS）引起的细胞凋亡是血管内皮损伤的重要原因[7-8]，因此探讨ERS诱导的内皮细胞凋亡机制是本课题组的研究方向，本课题组将通过构建DVT 小鼠模型，探讨ERS 在内皮细胞凋亡过程中的作用，进一步阐明DVT 形成的机理。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

32 只清洁级C57BL/6 小鼠购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2016-0002，在SPF 动物饲养室、室温（23±2）℃、湿度40%～50%，常规饲料喂养、自由饮水。动物实验通过中国科学院大学深圳医院动物实验伦理委员会审核通过。

1.2 实验试剂与仪器

即用型DAPI 染液（KGA215-50，凯基）；苏木素染液（AR11800-1，BOSTER）；伊红染色液（AR11800-2，BOSTER）；超净高级封片胶（YZB，BASO）；Scott 蓝化液（G1865，Solarbio）。Trizon Reagent（CW0580S，CWBIO 康为世纪）；TUNEL 检测试剂盒（C1088，碧云天）；RIPA 细胞裂解液（C1053，北京普利莱基因技术有限公司）；GRP78（ab21385，abcam）；Rabbit Anti CHOP（DF6025，Affinity，1/1000）；Rabbit Anti XBP1（AF5110，Affinity，1/1000）；Rabbit Anti GRP78（AF5366，Affinity，1/1000）；Rabbit Anti Cleaved caspase-3（ab2302，Abcam，1/1000）；辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（ZB-2301，中杉金桥，1/2000）。微型离心机（D1008E，SCJLOGEX）；旋涡混合器（XH-C，常州越新仪器制造有限公司）；紫外可见分光光度计（UV-1600PC，上海美谱达仪器有限公司）；低温高速离心机（TGL-16G，常州中捷实验仪器制造有限公司）；超高灵敏度化学发光成像系统[Chemi DocTM XRS+，伯乐生命医学产品（上海）有限公司]；蛋白垂直电泳仪（DYY-6C，北京市六一仪器厂）。

1.3 实验分组及造模

将32 只小鼠随机分为正常组、假手术组、模型组，正常组10 只，假手术组及模型组11 只，其中各1 只用于模型验证。模型组和假手术组小鼠按0.08 ml/10 g腹腔注射麻醉剂（5%水合氯醛），小鼠麻醉起效后，腹部剃毛，小鼠仰卧位放置在手术操作台上，消毒腹部，逐层开腹，将肠内容物挤出位于操作者左侧放置于生理盐水润湿的纱布上，暴露并分离下腔静脉，将分离出的下腔静脉与动脉同造模针头（直径0.3 mm，注射器针头）一起用4-0 医用真丝编织缝合线结扎，迅速抽出针头，并将下腔静脉的可见分支进行结扎，关腹。假手术组同样进行腹部消毒，开腹，暴露并分离下腔静脉，关腹。正常组不做处理。

1.4 取样

造模后24 h 取各组小鼠下腔静脉组织，正常组和假手术组将左肾静脉至髂总静脉分叉处之间的下腔静脉段剪下，模型组小鼠取成血栓及其相应的下腔静脉组织，每组取3 个样本置于10%福尔马林溶液中固定用于HE 染色，Tunnel 染色检测，每组取4 样本置于-80℃保存用于western blot 检测。

1.5 免疫荧光

组织切片入放入65°C 烤箱中烤2 h；甲苯放置10 min，更换二甲苯再放置10 min；将切片依次放入100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇和纯化水中各5 min。切片放入修复盒中，加入抗原修复液（柠檬酸缓冲液）修复，弃去抗原修复液，PBS 淋洗。0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透20 min。PBS 浸洗玻片3 次，每次5 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加5% BSA，37°C 封闭30 min。用吸水纸吸掉组织周围的封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗GRP78（1∶200），并放入湿盒，4℃孵育过夜。玻片复温至室温后，PBS 浸洗玻片3 次，每次3 min，吸水纸吸干玻片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗IgG/488（1∶200），湿盒中37℃孵育30 min。滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，用PBS 冲洗多余的DAPI，自来水冲洗1 min。用吸水纸吸干玻片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片。绿色荧光为目的蛋白，蓝色荧光为细胞核。

1.6 荧光定量PCR 检测糖调节蛋白78、X 盒结合蛋白1、CCAAT 增强子结合蛋白同源蛋白mRNA 含量

将组织研磨后，按照Trizon 试剂盒提取RNA，紫外可见分光光度计测定mRNA 浓度和纯度，根据Hi-FiScript cDNA 第一链合成试剂盒合成cDNA，以cDNA 为模板，在荧光定量PCR 仪上进行检测，以GAPDH为内参，计算出各组：糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）、X 盒结合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）、CCAAT 增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）mRNA 的相对表达量。操作体系：RNase Free dH2O 9.5 μL、cDNA 1 μL、Forward Primer 1 μL、Reverse Rrimer 1 μL、2×qPCR Mixture12.5 μl。反应程序，三步法：预变性：95℃、10 min，变性：95℃、10 s，退火：58℃、30 s，延伸：72℃、30 s，40个循环。融解曲线分析：95℃、15 s，58℃、1 min，95℃、15 s，58℃、15 s，58℃、15 s，95℃、0.5 s。

1.7 western blot 检测细胞中蛋白表达

收集细胞，加入细胞裂解液于4℃摇床上作用细胞30 min，后用移液枪反复的吹打细胞20 次左右，4℃、12000 r/m，直径15 cm，离心10 min，收集上清液。配置SDS 聚丙烯酰胺凝胶，测定蛋白浓度并加入上样缓冲液煮沸变性，蛋白样品上样后，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳直至目的蛋白分离，转聚偏氟乙烯膜30 min。5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，兔抗兔抗p53 上调凋亡调控因子（p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA）、细胞色素C（cytochrome C，Cyt C）、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，cleaved caspase 3）多克隆抗体溶液4℃过夜孵育，次日室温孵育二抗，将化学发光试剂加于膜上，于凝胶成像系统中曝光，并分析目的蛋白条带灰度值。

所有实验重复3 次。

1.8 统计学方法

应用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（

±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t 检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组小鼠静脉组织中GRP78 免疫荧光结果的比较

正常组小鼠静脉组织中GRP78 荧光强度为（5.39±1.21）与假手术组（5.78±0.89）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组小鼠静脉组织中GRP78 荧光强度（8.54±1.67）高于正常组和及手术组，差异有统计学意义（P<0.05）（图1，封四）。

2.2 三组小鼠静脉组织中GRP78、XBP1、CHOP mRNA 表达量的比较

模型组小鼠静脉组织中GRP78、XBP1、CHOP mRNA 表达量高于正常组及假手术组，差异有统计学意义（P<0.05）（图2）。

图2 三组小鼠静脉组织中GRP78、XBP1、CHOP mRNA 表达量

与正常组比较，aP<0.05；与假手术组比较，bP <0.05

2.3 三组小鼠静脉组织中PUMA、Cyt C 及cleaved caspase 3 表达量的比较

模型组小鼠静脉组织中PUMA、Cyt C 及cleaved caspase 3 蛋白表达量高于正常组及假手术组，差异有统计学意义（P<0.05）（图3、4）。

图3 western blot 检测三组小鼠静脉组织中PUMA、Cyt C及cleaved caspase 3 表达量

3 讨论

图4 三组小鼠静脉组织中PUMA、Cyt C 及cleaved caspase 3表达量

与正常组比较，aP<0.05；与假手术组比较，bP<0.05

DVT 的形成机理尚不明确，其预防与治疗仍是医学界的一个难题。目前普遍认为血管内皮细胞、血小板、血流的改变、凝血/抗凝系统、纤溶/抗纤溶系统、炎症因子等多种因素均有参与DVT 的形成。而且血流的改变、血管壁损伤及血液成分异常是血栓形成的三大因素[9-10]。血管壁损伤主要表现为血管内皮细胞损伤引起的细胞凋亡，是DVT 形成最为重要的原因[7-8]。而且静脉内皮细胞主要位于血管内侧，与血液系统直接相连，因此可以感知血液变化及分泌的多种血管物质（内皮素、凝血因子、血管紧张素等）进而对血管进行调节，所以具有强大的抗血栓形成功能。因此通过调节静脉内皮细胞的结构与功能对于DVT 的形成具有重要意义。

内质网是真核细胞中重要的细胞器，对膜蛋白、分泌蛋白的折叠与加工，钙的储存与释放具有重要调节作用，因此对细胞正常功能的维持至关重要。所以当内质网中蛋白的折叠、加工过程受阻，钙离子稳态被打破后会使细胞细胞发生致死性的损害。缺血缺氧、钙超载、氧化应激等外界刺激均会使内质网功能发生障碍，进而触发内质ERS[11-12]。

激酶R 样内质网激酶（proteinkinaseR—likeERkinase，PERK）、需肌醇酶1（inositol-requiring enzyme-1，IRE1）、活化转录因子6（activating transcription factor 6，ATF6）是ERS 主要的三条信号通路，其发挥作用需要借助内质网伴侣GRP78[13-14]。GRP78 是ERS 发生的标志，在受到刺激后，与PERK、IRE 1、ATF6 解离，激活这三条信号通路。其中激活的IRE1 活化XBP1，活化的XBP1 激活CHOP 凋亡途径，最终将信号传递给Caspase 家族，诱导细胞凋亡。CHOP 是ERS 特异的一个转录因子，ERS 的三条信号通路均可以诱导CHOP的转录。ATF4-CHOP 能够介导Bcl-2 家族成员PUMA 反式激活，ERS 发生时候，CHOP 能与PUMA启动子激活，CHOP 被敲除后，能够减弱PUMA 诱导的细胞凋亡[15-16]。另外ERS 发生时，致使大量的Ca2+从内质网中释放到线粒体结合内质网膜，使线粒体内Ca2+过量，扰乱了线粒体内的Ca2+稳态，致使线粒体通透性增加，促进Cyc C 被大量释放到细胞浆中，启动Caspase 级联反应，最后导致细胞凋亡[17-18]。因此探讨ERS 发生时的关键性蛋白的表达变化对于DVT 形成具有重要意义。

本研究首先通过免疫荧光测定GRP78 的荧光强度，结果表明模型组较正常组及假手术组GRP78 荧光强度提高，荧光定量PCR 结果表明模型组较正常组及假手术组GRP78 mRNA 表达量上调（P<0.05），提示DVT 形成过程也伴随着ERS 的发生。接着探讨ERS 发生过程中的关键蛋表达量的变化，荧光定量PCR 结果表明模型组较正常组及假手术组XBP-1、CHOP mRNA 表达量上升（P<0.05），western blot 结果表明模型组较正常组及假手术组中PUMA 蛋白表达量提高（P<0.05），进而提示GRP78/XBP1/CHOP 参与DVT 的形成。最后采用western blot 检测Cyt C、cleaved caspase 3 的表达，结果表明DVT 小鼠静脉组织中Cyt C、cleaved caspase 3 蛋白表达量较正常组及假手术组上调（P<0.05），从而提示不仅ERS 介导的静脉内皮细胞凋亡可能也与线粒体的损伤有关，并最终导致DVT 的形成。

综上所述，ERS 可能是导致DVT 小鼠细胞凋亡的重要原因。

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