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肺癌是临床常见的恶性肿瘤，具有较高的病发率与病死率，发病机制主要与患者吸烟、工作环境及遗传等因素有关，常表现为胸部疼痛、痰血、咳嗽、低热与呼吸困难等，而非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占80%，术后5年生存率较低，即使是Ⅰ期患者接受肿瘤完全切除术治疗后，仍有部分患者会在术后复发，而微转移是造成患者易反复与转移的预后指征，但该情况很难用临床常规病理学检测确诊，常隐匿在原病灶之外的组织中[1]。逆转录聚合链反应（reverse transcription polymer chain reaction，RTPCR）技术对肿瘤细胞有较高的灵敏度，可在10 个单个核细胞中准确检测出肿瘤细胞，是临床实体瘤完整性中微转移的常用措施[2-3]。本研究以RT-PCR 技术检测外周血细胞角蛋白（cytokeratin，CK19）、肺特异性X基因（lung-specific X gene，LUNX）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）mRNA 表达情况，探究其对NSCLC 患者早期转移的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取江西省胸科医院病理科2019年1月—2020年11月收治的52 例NSCLC 患者，术前均进行抗肿瘤治疗，排除患有其他恶性肿瘤或其他肿瘤肺部转移者，均经临床病理学组织确诊。其中男28 例，女24例；年龄32～75 岁，平均（52.31±3.22）岁；经胸片、胸部CT扫描、B 超等检查进行临床分期判定：Ⅰ期17 例，Ⅱ期21 例，Ⅲ期14 例。以同时期入院体检的30 例正常体检者作为参照组，其中男16 例，女14 例；年龄30～68岁，平均（52.66±3.56）岁。两组的一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。参与者均知情并签署同意书，且本研究已经医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 方法

于治疗前抽取肺癌患者与正常体检者的静脉血5 mL，以淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限责任公司）将有核细胞分离，清洗后，离心（离心半径为10 cm，离心转速为3000 r/min，离心时间为15 min）取上清液；保存在1.5 mL 无菌Ep 管中，然后加入1000 μL Trizol（Invitrogen 公司）消化，经氯仿抽提，异丙醇沉淀总RNA，经75%乙醇漂洗，气干后加入15 μL 无菌DEPC 水将其溶解，行逆转录反应（严格遵循说明书操作）。

1.3 观察指标

记录两组外周血CK19、LUNX、CEA mRNA 表达阳性率，具体测量方法：将10 μL PCR 产物与β-actin PCR 产物、1.7 μL 澳酚上样缓冲液混匀，将其加入1.5%琼脂糖凝胶上，以100 bp Ladder Marker 加样，然后将其作为分子量标志；保持恒压80 V，电泳40 min，行EB 染色，于UVB 凝胶成像系统下摄片，测量各条带荧光强度。并分析细胞分化程度、TNM 分期与NSCLC患者各项外周血肿瘤标志物mRNA 表达的关系。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（

±s）表示，两组间比较采用t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。计数资料采用率表示，多组间率的整体比较采用χ2 检验，多组间率的两两比较采用Bonferroni 方法矫正，检验水准α=原α水平/比较次数，即0.05/3=0.0167。

2 结果

2.1 两组外周血CK19、LUNX、CEA mRNA 表达阳性率的比较

NSCLC 组外周血CK19、LUNX、CEA mRNA 表达阳性率均高于参照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 两组外周血CK19、LUNX、CEA mRNA 表达阳性率的比较[n（%）]

2.2 细胞分化程度与NSCLC 患者各项外周血肿瘤标志物mRNA 表达的关系

三种分化程度的CK19 mRNA 阳性率、CEAmRNA 阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；高分化程度的LUNX mRNA 阳性率低于中、低分化程度，差异有统计学意义（P＜0.0167）；而中、低分化程度的LUNX mRNA 阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.0167）（表2）。

表2 细胞分化程度与NSCLC 患者各项外周血肿瘤标志物mRNA表达的关系[n（%）]

与高分化程度比较，aP＜0.0167

2.3 TNM 分期与NSCLC 患者各项外周血肿瘤标志物mRNA 表达的关系

三种TNM 分期的CK19 mRNA 阳性率、CEA mRNA 阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；Ⅲ期的LUNX mRNA 阳性率高于Ⅰ期、Ⅱ期，差异有统计学意义（P＜0.0167）；而Ⅰ期、Ⅱ期的LUNX mRNA 阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.0167）（表3）。

表3 TNM 分期与NSCLC 患者各项外周血肿瘤标志物mRNA 表达的关系[n（%）]

与Ⅲ期比较，aP＜0.0167

3 讨论

肺癌是目前临床常见的恶性肿瘤，具有较高的发病率，且大部分患者为NSCLC。近年来随着临床医疗技术与肿瘤疾病的深入研究，于早期与中期实施肺癌手术切除，可有效改善患者病情，且成功率较高，但患者5年的生存率总徘徊在20%左右[4-5]。有数据表明，NSCLC 患者预后的改善，与其肿瘤细胞转移有密切关系[6-7]。而肿瘤转移需多个步骤，主要是经血液循环与淋巴循环进行转移，属于恶性肿瘤的发展过程，可播散并存在患者的血液、淋巴、骨髓与各组织器官中，且尚未形成的转移性结节无明显临床特征，经常规的病理学与影像学等方法检测很难发现[8-9]。目前临床针对肺癌转移情况主要以影像学检查与病理学检查为主，但效果并不理想。因癌细胞可能是患者术后肿瘤全身转移的根源，其外周血中的癌细胞则预示肿瘤具有转移倾向，是表明患者肿瘤转移与复发的重要表现[10-11]。目前临床实施的外周血特异性肿瘤标志物mRNA 表达检测NSCIC 微转移情况，具有较高的敏感性与特异性，其标志物主要为CK19、CEA、LUNX 等[12-13]。

本研究以52 例NSCLC 患者为研究对象，以上述外周血特异性肿瘤标志物mRNA 表达为指标实施检测，其中NSCLC 患者CK19、LUNX、CEA mRNA 的阳性率分别为38.46%、57.69%、44.23%，与参照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示若在患者外周血检测到CK19、LUNX、CEA mRNA 表达，则表明患者体内有完整的癌细胞存活。同时对不同分化程度的NSCLC 患者肿瘤标志物mRNA 表达阳性率进行比较，结果显示，LUNX mRNA 阳性率随分化程度升高而降低，高分化程度患者低于中、低分化患者（P＜0.0167），而三种分化程度的CK19 mRNA 阳性率、CEAmRNA 阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表明LUNX mRNA 诊断效能优于CK19、CEA mRNA。对不同分期的NSCLC 患者肿瘤标志物mRNA 阳性率进行比较，发现LUNX mRNA 阳性表达率随着临床分期的加重而增高，Ⅲ期的LUNX mRNA 阳性率高于Ⅰ、Ⅱ期（P＜0.0167），表明NSCLC 患者的分期愈晚，肺癌细胞脱落至血循环的危险性愈大。本研究结果证实，以LUNX mRNA 表达作为NSCLC 患者的微转移提示指标，可发挥显著的敏感性与特异性。而肺癌患者外周血中LUNX mRNA 表达可能来自转移癌细胞，可准确提示肿瘤的转移倾向，解释了临床部分患者早期无任何转移征象肿瘤，经手术完整切除后仍会在短时间内复发或转移。故LUNX mRNA 可作为NSCLC微转移检测的分子标志物[14-15]。虽然微转移是形成远处转移的必要条件，但有少量的肿瘤细胞检出，并不代表最终会形成显性转移，其中肿瘤细胞自身生物学特性、局部微循环与机体免疫等情况均是重要的影响原因，若检测出肿瘤细胞，则预示着患者有发生转移的危险性。随着临床生命科学研究的不断深入，分子生物学技术日益完善，再加上其他新兴技术的推广，必将会为肿瘤的深入研究提供可靠条件，因此在日后需深入探究NSCLC 外周血特异性肿瘤标志物mRNA表达与微转移的关系，对患者病程进展、预后评估与临床指导治疗有重要意义。

综上所述，肺癌患者微转移的临床意义需更深层次的论证，后期需对肺癌患者进行密切随访，从而深入明确mRNA 阳性表达与肿瘤转移、预后的关系。当然临床一次的检测结果为阴性，并不代表患者无肿瘤微转移情况，因肿瘤细胞可间断的脱落进入循环系统，且在短时间内会被机体的免疫系统破坏，故针对患者肿瘤细胞微转移情况仍需多次反复检测，从而提高诊断的准确性与特异性。

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