乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（hepatitis B virus de oxyribonucleic acid，HBV DNA）的定量检测可反映病毒复制水平，主要用于慢性HBV 感染的诊断、治疗适应证的选择及抗病毒疗效的判断[1-2]。临床实验室主要采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，q-RT-PCT）检测HBV DNA，因此HBV DNA 检测的准确性将直接影响患者的诊断和治疗。本文以《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明 （CNAS-CL36）》[3] 为依据，参考美国临床和实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP 系列文件及相关文献，对HBV DNA 检测方法在该室荧光定量PCR仪上的运作，制定一套验证方案，包括精密度、测量正确度、抗干扰能力、线性范围和检测下限等，以保证检测结果的准确可靠，符合临床需求。

采用该实验室收集的高浓度（1×106 U/mL）、低浓度（1×103 U/mL）阳性血清用于精密度验证；高浓度临床标本（1.45×109 U/mL）用于线性分析；正确度验证所用标准品为2020年4月国家卫健委临检中心室间质控品；HBV DNA 阴性血清为正常人HBV 表面抗原阴性血清；厂家标准参考物、阴、阳性样本等使用试剂盒提供的对照品。均保存于-20℃冰箱。

美国ABI 7500 荧光定量PCR 仪；生物安全柜；湖南圣湘公司HBV DNA 定量检测试剂盒（生产批号：2020004、2020007）。

直接在PCR 反应管中加入5 μL 核酸释放剂，然后加入5 μL 标本（血清、血浆、标准品、对照品、质控品），连续吹打5 次，静置10 min 后，加入40 μL已配制好的反应液，盖上管盖，置于八联管离心机上2000 r/min 瞬时离心10 s，然后放置于荧光定量PCR仪上进行检测。热循环条件：50℃2 min；94℃5 min；94℃15 s，57℃30 s 进行45 个循环，并在57℃30 s 采集荧光基团FAM、荧光分子VIC 通道的荧光信号[4]。

1.4.1 精密度 参考EP15-A2 文件[5]。重复性精密度（批内精密度）：选取高值（1×106 U/mL）、低值（1×103 U/mL）临床血清标本各1 份，每份标本重复做20 次，作为批内试验；中间精密度（批间精密度）：将高、低浓度两个水平的标本，在同一批试验中重复检测5 次，连续检测4 d，每个水平共收集20 个数据；分别统计两个水平标本检测值的均值和标准差，再计算CV 值。以能力验证/室间质评评价界限（靶值±lg0.4）作为允许总误差（TEa），要求重复性精密度<3/5 TEa（0.24），中间精密度<4/5 TEa（0.32）。

1.4.2 正确度 参照EP15-A2 文件的参考物质方案，使用2020年国家卫健委临检中心的室间质评品202011～202015，评价该试剂盒检测的正确性。将已知浓度的5 个质控品连续检测2 次，计算均值和偏差，根据国家卫健委临检中心室间质评要求绝对偏差（测定值-靶值）≤±lg0.4。

1.4.3 抗干扰能力 按EP7-A2 方案[6]要求，以厂家HBV DNA 标准参比物（4×104 U/mL），分别取三酰甘油34.0 mmol/L、总胆红素476.0 μmol/L、血红蛋白20 g/L 及正常人HBV DNA 阴性的血清样本，按1∶100比例配制相应的三酰甘油浓度34.0 mmol/L、总胆红素476.0 μmol/L、血红蛋白20 g/L 及正常对照的HBV DNA 分析浓度为1×102 U/mL 的4 份弱阳性样本，每份样本重复测定3 次，计算测试样本和对照样本的测量均值间的差值，要求差值≤±lg0.4。

1.4.4 线性范围 以EP6-A 文件[7]推荐的方法，将高值阳性标本（1.45×109 U/mL）用阴性血清进行系列梯度稀释(1∶102～1∶108)至145 U/mL，对稀释后的标本进行同批次检测，每个标本重复检测3 次，对测量值和预期值进行线性回归分析，得出线性回归方程Y=bX+a，要求满足b 在1±0.05 范围内，a 接近于0，R2≥0.95。

1.4.5 检测下限 参考EP6-A，将厂家HBV DNA 标准参比物（4×104 U/mL）用阴性血清进行梯度稀释至浓度接近试剂盒定量检测下限以下，分别为40 U/mL、100 U/mL、200 U/mL 和400 U/mL，对稀释后的标本重复检测5 d，要求检出率100%，CV<20%的最低浓度，即为可定量的最低检测限。

所有检测结果均进行以10 为底数的对数转换，采用Microsoft Excel 2010 表格计算计量资料的均数、标准差和CV，线性范围采用平均斜率法。

实验室收集的低、高值浓度样本范围分别为1×103 U/mL 及1×106 U/mL，两个浓度批内及批间各重复做20 份。实验结果统计如表1 和表2所示，低浓度和高浓度标本批内及批间CV 值均小于5%，且重复性精密度<3/5 TEa（0.24），中间精密度<4/5 TEa（0.32），均在允许范围内。

表1 重复性精密度验证结果（U/mL）

表2 中间精密度验证结果（U/mL）

采用国家卫健委临检中心的室间质评品202011～202015，实验结果统计如表3所示，绝对偏差≤±lg0.4，正确度验证通过。

表3 正确度验证结果

测试3 种常见抑制物对HBV DNA 检测影响结果如表4。34.0 mmol/L 的三酰甘油、476.0 μmol/L 的总胆红素和20 g/L 的血红蛋白对HBV DNA 检测无干扰，差值

表4 三种抑制物对弱阳性HBV DNA 检测结果干扰（U/mL）

对各梯度浓度测量结果做平均斜率法以验证线性范围，结果如表5 和图1所示，测量值与预期值的直线回归方程为Y=1.042X-0.337，R2=0.997，各项指标均通过，符合试剂说明书声称的定量线性范围1.0×102～5.0×109 U/mL。

表5 测量值与预期值结果

 

图1 测量值与预期值线性关系

标准参比物稀释至浓度40、100、200、400 U/mL，结果如表6所示，HBV-DNA 浓度大于或等于100 U/mL时，阳性检出率为100.00%，天间重复CV≤20%，而40 U/mL 的阳性检出率为60.00%。厂家公布的定量检测下限100 U/mL 验证合格。

表6 灵敏度验证结果

最新版《慢性乙型肝炎防治指南》对乙肝抗病毒治疗适应证作了新的扩展：只要HBV DNA 阳性，转氨酶持续异常且排除其他原因所致者，即应开始抗病毒治疗；而对于转氨酶正常但有HBV DNA 活跃复制者，也建议应及早抗病毒治疗[8]，表明HBV DNA 检测结果的准确性将影响临床治疗及预后判断，HBV DNA 定量检测具有重要的指导作用[9-10]。因此为保证检测结果的准确性，实验室自身对HBV DNA 荧光定量检测方法的性能验证尤为重要。CNAS-CL36 要求在分子诊断领域性能验证内容至少应包括正确度、精密度、线性、最低检出限等内容，但没有具体的评价方案。PCR 检测性能评价的实验设计及数据分析相比生化、免疫、临检等领域尚无权威机构发布的成熟方法，因此，目前国内主要参照CLSI 的系列标准文件进行分析，相关文献对此报道不少[11-13]。

本文主要参考CLSI 的EP15-A2，EP7-A2，EP6-A等文件，对HBV DNA 荧光定量检测方法进行性能验证。精密度是反映结果一致性的指标，本研究结果显示，HBV DNA 低值和高值的重复性精密度<3/5 TEa，中间精密度<4/5 TEa，CV<5%，符合CNAS-CL36 的要求，验证通过。实验室对正确度的评价实际上就是偏倚计算的过程，本次国家卫健委临检中心的室间质评物结果均在允许偏差内。但此次质控品没有高浓度样本，对正确度的全面评价存在不足，需对往后的日程检测做进一步评估。抗干扰方面常用添加外源性干扰物来验证，但笔者认为，实验样本基质不代表典型有问题的临床样本，所以采用EP7-A2 的方案，选取真实的特定患者标本（高血脂、高胆红素、溶血等）以减少基质效应，更能直接评价病理血清标本中存在的干扰效应[14-15]。检测结果均4～4.0×107 U/mL 范围内，为达到更宽的可报告范围，标准都进行了两端延伸，因此有必要对线性范围进行验证。线性评价选用1×109 U/mL 的临床样本倍比稀释后，得到涵盖线性范围的8 个浓度，将测量值与预期值进行多项回归分析，验证结果为一阶方程式，表明线性关系良好。检测下限的验证对于PCR 检测项目非常重要。EP6-A 文件指出，阳性检出率为100%，天间重复测量CV<20%的最低浓度可作为最低检测限。结果显示100 U/mL 的检测下限符合厂家声明。CNAS-CL36 提出可报告范围高限的确定应考虑临床需求。本实验室以往检测的HBV DNA 结果均未超出1×109 U/mL，故本研究未对可报告范围最高检测限进行验证。

综上所述，检测系统性能验证或评价不仅是相关文件法规的要求[16]，也是质量管理体系的要求。有专家指出不同的检测项目和检测系统除需选择不同的方法学验证程序外，还应充分考虑验证方法的适用性及科学性[17-18]。因此，实验室应根据自身检测需求，对检测系统性能进行规范化的验证，保证实验结果的准确，使开展的检测项目发挥临床应有的作用。

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Performance verification and evaluation of fluorescent quantitative detection method for HBV DNA

CHEN Mei-lian XIE Li-zhu MO Qi-wen LI Liu-yan XIE Ling-ping FANG Xiu-zhu
Department of Medical Laboratory,the Affilated Houjie Hospital of Guangdong Medical College,Guandong Province,Dongguan 523945,China

[Abstract]Objective To verify performance and evaluation of fluorescent quantitative detection method for hepatitis B virus deoxyribonucleic acid(HBV DNA).Methods According to the requirements of Application of accreditation criteria for quality and competence of medical laboratories in molecular diagnosis(CNAS-CL36)and EP series documents by the Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI),the precision,measurement accuracy,anti-interference ability,linear range and limit of detection of HBV DNA fluorescence quantitative PCR detection system were verified and evaluated.Results The intra assay CV of low(1×103 U/mL)and high(1×106 U/mL)value specimens were 0.07% and 0.06%,respectively,while the inter assay CV were 0.11% and 0.08%,respectively.Its accuracy was within acceptable range.The samples containing triglyceride,bilirubin,hemoglobin were detected,and the deviation between the measured value and the expected value was ≤±lg0.4.It exhibited a benign linear relation from 1.45×102-1.45×109 U/mL(Y=1.042X-0.337，R2=0.997),and the limit of detection was 100 U/mL.Conclusion The performance indexes of the fluorescent quantitative detection method of HBV DNA are consistent with the manufacturer′s statement,which can be used for routine clinical detection.

[Key words]Hepatitis B virus; Nucleic acid quantification; Performance verification; Fluorescence quantitative PCR

[作者简介]陈梅莲（1980-），女，副主任技师，研究方向：分子诊断、临床检验

（收稿日期：2021-02-20）