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2019年我国癌症中心统计数据显示，原发性肝癌在我国常见恶性肿瘤中的发病率居第四位，死亡率居第二位，肝癌的远端侵袭转移是其主要死亡原因[1-2]。侵袭转移的过程包括肿瘤细胞间的紧密连接破坏、黏附减弱、基质降解及细胞的迁移运动等[3-4]，低氧、炎症反应和肿瘤微环境的改变等多种因素都会影响肿瘤细胞的侵袭转移[5-6]。有研究表明，实体瘤中经常出现低氧，氧浓度越低提示肿瘤越易发生侵袭转移且预后越差[7]。

神经轴突导向因子Netrin-1 最初是从神经系统中分离出来的一种层状蛋白[8]，其在神经轴突生长的调节、肿瘤血管的生成、炎症的调控、心脑血管疾病及多种肿瘤的侵袭转移等多方面均发挥重要作用[9-12]。文献表明，低氧可以促进肝癌细胞Netrin-1 的分泌[13]，但在低氧环境下Netrin-1 在肝癌细胞中表达的变化及其对肝癌细胞迁移侵袭、凋亡的影响，目前相关报道罕见。本研究拟通过构建靶向Netrin-1 的小片段RNA 干扰质粒抑制肝癌细胞HepG2 细胞中Netrin-1的表达，研究低氧条件下肝癌细胞迁移侵袭及凋亡的变化，为进一步探索肝癌侵袭转移的分子机制提供理论基础及有效的干预靶点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人肝癌HepG2 细胞由华中科技大学附属同济医院肝病研究所提供。干扰质粒的空载体pGensil-1 及阳性质粒shRNA-Netrin-1 由武汉晶赛生物有限公司提供。转染试剂脂质体lipofectamine2000 购于美国Introvigen 公司，G418 购于南京都莱生物技术有限公司，胎牛血清及DMEM 细胞培养基购于Gibco 公司，Netrin-1 兔抗人多克隆抗体、β-actin 抗体购于美国Santa Cruz 公司，ECL 试剂盒购于Pierce 公司，Transwell 小室板购于美国Corning 公司，Annexin-Ⅴ/FITC流式细胞检测试剂盒购于上海锐赛生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养配置10%胎牛血清的DMEM 细胞培养基用来培养肝癌细胞HepG2，待细胞融合度接近80%以上时，用0.25%胰酶消化后制成单细胞悬液，置于37℃含5% CO2、95% O2 的细胞培养箱中，细胞贴壁后，取出放入N2 浓度为94%、CO2 浓度为5%、O2 浓度为1%的低氧培养箱中培养，24 h 后进行相关检测。

1.2.2 shRNA-Netrin-1 质粒构建及鉴定通过GeneBank 查询人Netrin-1 基因序列，利用Invitrogen公司的shRNA 在线设计软件，设计特异性针对Netrin-1基因的小分子干扰RNA 序列：5′-GGGAAGCTGAAGATTAACA-3′，同时利用BLAST 分析序列特异性，证明该序列与其他基因没有同源性。正反义链之间插入发卡序列TTCAAGACG，加入终止子TTTTTT稳定终止转录，两端分别设计BamHⅠ及Hind Ⅲ的酶切位点[14]。应用T4 连接酶将干扰RNA 片段与pGensil-2 载体连接并行DH5α 转化，挑选卡那霉素阳性的克隆进行扩增培养，快速小量提取质粒后进行测序鉴定，Netrin-1 的干扰质粒命名为shRNANetrin-1。

1.2.3 基因转染及稳定筛选细胞株将shRNA-Netrin-1及空载体pGennsil-2 分别转染入HepG2 细胞中，24 h 后加入G418（浓度600 μg/mL）稳定筛选4 周，挑选单细胞克隆并扩大培养，分别命名为shRNANetrin-1-HepG2、HepG2-control 细胞，培养后进行相关的检测。

1.2.4 Western-blot 检测采用RIPA 裂解肝癌细胞，提取总蛋白并测定蛋白的浓度，配制12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，取50 μg 总蛋白进行电泳，每孔样本量为30 μL，电泳结束后将蛋白转移至硝酸纤维素膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h 后，加入兔抗Netrin-1 多克隆抗体（稀释倍数1∶2000）4℃孵育过夜，TBST 振洗3 次×10 min 后加入羊抗兔二抗（1∶5000 稀释）室温孵育1 h，TBST 振洗5 次×10 min，然后采用ECL 试剂显影发光，胶片曝光保存，以βactin 为内参照。Western-blot 检测未转染组（HepG2细胞）、转染空质粒组（HepG2-control 细胞）、转染干扰质粒组（shRNA-Netrin-1-HepG2 细胞）这三组细胞在正常及低氧环境中分别培养24 h 后Netrin-1 蛋白表达的变化。

1.2.5 细胞迁移实验取对数生长期的细胞于无血清培养基中培养24 h，经0.25%胰酶消化后制成单细胞悬液，加入Transwell 小室上层，约1×105 细胞/室，下室加入DMEM 培养基+10% 胎牛血清，将HepG2、shRNA-Netrin-1-HepG2、HepG2-control 细胞分别于常氧、缺氧培养箱中孵育24 h（37℃）。取出Transwell 小室后，用棉签擦净上室面上的细胞，PBS漂洗2 次，5 min/次，95%乙醇固定10 min，0.1%结晶紫染色10 min，PBS 漂洗3 次，5 min/次，于倒置显微镜（100×）下计数5个高倍视野的滤膜下室的细胞数取均数，各实验重复3 次。

1.2.6 细胞凋亡实验调整细胞浓度为1×105/EP 管，细胞离心，2000 r/min 离心5 min，弃上清液后加入200 μL PBS 重悬细胞，并重复步骤2 次，之后每管加入结合缓冲液200 μL+异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothio cyanate isomer，FITC）5 μL，混匀避光10 min 后加入碘化吡啶（propidium，PI）5 μL，10 min 后于流式细胞检测仪检测相关细胞的凋亡情况。收集下列各组细胞：①HepG2 细胞正常环境培养24 h；②HepG2 细胞低氧培养24 h；③HepG2-control 细胞低氧培养24 h；④shRNA-Netrin-1-HepG2 细胞低氧培养24 h。利用Annexin-Ⅴ/FITC 凋亡试剂盒检测上述各组细胞的凋亡情况，每组实验均重复3 次。

1.3 统计学方法

应用SPSS 21.0 软件对实验结果进行统计学分析，数据以均数±标准差（

±s）表示，多组数据之间比较应用one way ANOVA 检验，两组数据之间比较应用t 检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常和低氧培养环境下HepG2 细胞中Netrin-1蛋白表达的变化

将HepG2 细胞置于正常及低氧环境中分别培养24 h 后，低氧环境中Netrin-1 蛋白的表达量明显增加（图1A）；正常及低氧环境中，Netrin-1 相对表达灰度值分别为0.143±0.013、0.398±0.031，差异有统计学意义（P<0.05）（图1B）。

图1 正常及缺氧环境下HepG2 细胞中Netrin-1 蛋白的表达变化

A：两组蛋白Western-blot 表达的变化；B：两组Netrin-1 蛋白具体灰度值的比较（与正常环境比较，aP＜0.05）

2.2 shRNA-Netrin-1 质粒及空载体质粒转染HepG2细胞后Netrin-1 蛋白表达的变化

正常环境下，HepG2 细胞、HepG2-control 细胞、shRNA-Netrin-1-HepG2 细胞中Netrin-1 蛋白表达的相对值分别为0.172±0.012、0.183±0.016、0.049±0.012，shRNA-Netrin-1 质粒稳定转染入HepG2 细胞后，Netrin-1 蛋白的表达量下降，差异有统计学意义（P<0.05）。低氧环境下，HepG2 细胞、HepG2-control 细胞、shRNA-Netrin-1-HepG2 细胞中Netrin-1 蛋白表达量的相对值分别为0.412±0.022、0.425±0.019、0.136±0.016。在低氧环境下，shRNA-Netrin-1-HepG2 细胞中Netrin-1 蛋白的表达量低于未转染质粒的HepG2细胞及转染空质粒的HepG2-control 细胞，差异有统计学意义（P<0.05）；未转染质粒的HepG2 细胞及转染空质粒的HepG2-control 细胞中Netrin-1 蛋白的表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05）（图2）。

图2 正常和低氧条件下不同细胞中Netrin-1 表达的变化

2.3 低氧环境下抑制Netrin-1 表达对肝癌细胞HepG2迁移侵袭的影响

正常条件下未转染质粒的HepG2 细胞透膜数为（201±11）个（图3A），低氧环境下未转染质粒的HepG2细胞透膜数为（382±21）个（图3B），低氧环境下HepG2细胞的透膜数多于正常条件下，差异有统计学意义（P<0.05）。低氧环境下HepG2-control 细胞透膜数为（362±18）个（图3C），shRNA-Netrin-1-HepG2 细胞透膜数为（216±20）个（图3D）；低氧环境下shRNA-Netrin-1-HepG2 细胞透膜数少于HepG2-control 细胞，差异有统计学意义（P<0.05）。

图3 不同细胞在不同条件下迁移结果的比较（Transwell 小室，n=3，100×）

A：HepG2 正常条件；B：HepG2 低氧条件；C：HepG2-control 低氧条件；D：shRNA-Netrin-1-HepG2 细胞低氧条件

2.4 低氧环境下抑制Netrin-1 表达对肝癌细胞HepG2凋亡的影响

正常环境培养24 h 的HepG2 细胞早期凋亡比例为（3.96±0.29）%（图4A），低氧环境培养24 h 的HepG2 细胞、HepG2-control 细胞、shRNA-Netrin-1-HepG2 细胞早期凋亡比例分别为（1.51±0.19）、（1.47±0.16）、（4.02±0.21）%（图4B～4D），低氧环境下HepG2细胞较正常环境下的早期凋亡比例减少，差异有统计学意义（P<0.05）。转染干扰质粒shRNA-Netrin-1 后，低氧环境下shRNA-Netrin-1-HepG2 细胞较HepG2细胞、HepG2-control 细胞的凋亡比例均升高，差异有统计学意义（P<0.05）（图5）。

图4 不同细胞在正常和低氧条件下的早期凋亡情况

A：HepG2 细胞正常环境培养24 h；B：HepG2 细胞低氧培养24 h；C：HepG2-control 细胞低氧培养24 h；D：shRNA-Netrin-1-HepG2 细胞低氧培养24 h

图5 细胞在正常和低氧条件下早期凋亡的比较

与shRNA-Netrin-1-HepG2 细胞比较，aP＜0.05

3 讨论

原发性肝癌的远处转移是肝癌患者死亡的主要原因[15]，探索肝癌早期的转移机制以获得干预靶点对提高肝癌患者的生存率尤其重要[16]。肝癌细胞的生长一般都伴随着肝癌组织的缺氧，缺氧可以促进肿瘤细胞基因表达、改变细胞的信号传递，从而促进肿瘤细胞的迁移和远处转移[17]。所以探讨缺氧对肝癌肿瘤细胞转移的影响，可能为抑制肝癌细胞的侵袭转移提供切入点。

Netrin 家族是重要的神经轴突导向因子，其中Netrin-1 是该家族中的重要成员之一[18]。研究人员也越来越重视Netrin-1 在恶性肿瘤侵袭转移中发挥的作用[19]。黄焕军等[20]研究发现，Netrin-1 在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织。本研究根据肝癌组织缺氧的特点，研究在低氧条件下肝癌细胞HepG2 中Netrin-1 表达的变化及其对细胞迁移侵袭、凋亡的影响，结果显示，在低氧培养24 h 后，HepG2 细胞中Netrin-1 蛋白的表达明显增加，且其细胞的迁移侵袭能力显著增强，细胞凋亡比例明显减少，证实低氧可以促进肝癌细胞HepG2 的侵袭转移，降低其细胞凋亡率，这可能是肝癌易发生侵袭转移的重要因素。同时，低氧环境下Netrin-1 表达水平明显升高，提示Netrin-1 的表达高低与肝癌细胞的侵袭转移力相关。

通过构建针对Netrin-1 的小干扰片段RNA 质粒，转染入肝癌细胞HepG2 中，通过G418 筛选成功转染的细胞株，经Western-blot 证实在正常及低氧环境下，shRNA-Netrin-1 可以显著抑制HepG2 细胞中Netrin-1 蛋白的表达。细胞迁移及侵袭试验的结果提示，低氧条件下，HepG2 细胞的透膜数明显增加；抑制Netrin-1 的表达后，低氧条件下透过基底膜的细胞数明显少于HepG2 及HepG2-control 细胞，表明Netrin-1 蛋白表达量的高低与肝癌细胞的迁移侵袭力相关。流式细胞学检测结果显示，低氧可以降低肝癌细胞HepG2 的早期凋亡比例，但抑制Netrin-1 蛋白的表达后，低氧条件下shRNA-Netrin-1-HepG2 细胞较HepG2 细胞、HepG2-control 细胞的早期凋亡比例均明显升高，提示低氧环境下抑制Netrin-1 的表达可以促进肝癌细胞HepG2 凋亡。

综上所述，Netrin-1 在低氧促肝癌细胞侵袭转移、抑制细胞凋亡的过程中发挥重要的作用，可能为开辟肝癌基因治疗的新靶点，但其在体内的侵袭转移过程中的分子机制仍需进一步研究。

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