肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是恶性肿瘤肝癌的最常见病理类型，在我国，HCC 的发病率、病死率居恶性肿瘤第4 位和第2 位，目前我国已成为肝癌大国[1-3]。HCC 的早期症状不明显，确诊时多半已到中晚期，此时最有效的治疗方法是手术切除，但适合手术的患者仅占一小部分，且由于癌细胞易转移导致肿瘤复发率较高，患者5年生存期率较低[4-5]。因此深入研究HCC 的发生发展机制，对改善患者的预后有重要意义。微小RNA（microRNA，miR）是内源性非编码小分子RNA，与靶基因mRNA 的3′UTR 区结合可参与基因转录后调控机制，在肿瘤发生发展中可发挥癌基因或抑癌基因的作用[6-7]。miR-552、miR-383 分别对骨肉瘤、非小细胞肺癌的增殖、侵袭、迁移调控过程已有报道[8-9]，但两者对HCC 发生发展的调控作用研究较少。本研究将通过检测HCC 组织中miR-552、miR-383 表达情况，探讨两者对患者预后的影响。

选取2011年2月—2014年2月于广州市花都区人民医院住院并行根治性切除术的68 例HCC 患者，男39 例，女29 例，平均年龄（58.45±11.85）岁。纳入标准：①手术组织病理证实为HCC；②患者对本研究知情且签署知情同意书。排除标准：①合并其他肿瘤、精神障碍者；②术前接受过局部放疗、全身化疗或其他抗肿瘤治疗者；③资料不完整或不真实者。本研究经广州市花都区人民医院医学伦理委员会审核批准。

Trizol 总RNA 抽提试剂盒（货号：SK1322）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；逆转录试剂盒（货号：CD-102539GM）购自武汉纯度生物科技有限公司；SYBR GreenⅠ（货号：04913850001）购自美国Rochc公司；miR-552、miR-383 和U6 引物均由华大基因科技有限公司合成；紫外分光光度计（型号：NanoDrop 2000）购买自美国Thermo Fisher 公司；荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（型号：ABI 7500）购买自美国Applied Biosystems 公司。

1.3.1 HCC 组织、癌旁正常组织收集

取患者HCC 组织作为研究样本，取癌旁正常组织（距肿瘤边缘>5 cm）作为对照样本，所有样本均经术后组织病理学检查证实，手术样本离体后均保存液氮中用于后续实验。

1.3.2 实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）法检测miR-552 和miR-383 的表达水平

1.3.2.1 RNA 提取 参照Trizol 试剂盒说明书提取HCC 组织及癌旁正常组织中的总RNA；用紫外分光光度计测定RNA 浓度与纯度，260、280 nm 波长处RNA样本吸光度值比值为1.8～2.0 时，说明RNA 的纯度较好；采用琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA 完整性。

1.3.2.2 cDNA 合成 参照逆转录试剂盒说明书将总RNA 逆转录成cDNA。将含有1 μL RNA、1 μL 通用引物、9 μL ddH2O 的混合液置于无菌Eppendof 管中，65℃水中5 min，冰上5 min；依次加入4 μL 5×buffer、1 μL RNA 酶抑制剂，2 μL 10 mmol/L dNTP 和1 μL逆转录酶，加入DEPC 水补至20 μL，充分混匀后42℃水浴60 min，70℃水浴5 min；检验合成cDNA 质量，合格后-80℃保存备用。

1.3.2.3 qRT-PCR 法检测miR-552、miR-383 水平 以U6基因为内参基因，采用qRT-PCR 仪对miR-552、miR-383 进行扩增。10 μL 反应体系：5 μL SYBR Green Mix，1 μL 50 ng/μL cDNA，0.5 μL 10 μm 正向引物，0.5 μL 10 μm 反向引物和3.0 μL ddH2O。反应条件：95℃90 s，95℃30 s，63℃30 s，40 个循环终止。miR-552 正向引物：5′-CCGCACAGGTGACTGGTTAGA-3′，反向引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-383 正向引物：5′-CACGAAAGATCAGAAGGTGATTG-3′，反向引物：5′-TATCGTTGTTCTCGTCTCCATCTC-3′；U6 正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACG CTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-552、miR-383相对表达量以2-ΔΔCt 法表示，Ct 值为扩增产物量达到临界阈值时对应的循环数。

检测HCC 组织及癌旁正常组织中miR-552、miR-383 的表达水平，收集HCC 患者的性别、年龄、有无肝硬化、组织分化程度[10]、肿瘤直径、有无淋巴结转移、有无远处转移、TNM 分期[11]、有无血管侵袭等一般资料。患者术后通过复诊和电话方式进行随访，每例患者均随访60 个月（5年），记录生存时间，存活不足60 个月者为预后不良。

采用SPSS 24.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验； 计数资料采用率表示，组间比较采用χ2 检验；Kaplan-Meier 生存曲线分析影响HCC 术后预后的因素，行Log-rank 检验；COX 回归分析影响HCC 术后5年预后结局的因素，以P<0.05 为差异有统计学意义。

HCC 组织中的miR-552 相对表达量高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P<0.05）；HCC 组织中的miR-383 相对表达量低于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

表1 miR-552、miR-383 在HCC 组织及癌旁正常组织中表达水平的比较（±s）

68 例HCC 患者按癌组织的miR-552 相对表达量高低，将患者分为miR-552 低表达组（miR-552 相对表达量<1.28，n=26）、miR-552 高表达组（miR-552相对表达量>1.28，n=42）。

miR-552 低表达组与miR-552 高表达组患者的年龄、性别、肝硬化比例比较，差异无统计学意义（P>0.05）；miR-552 低表达组患者的组织高分化、肿瘤直径≥5 cm、发生淋巴结转移、发生远处转移、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、发生血管侵袭比例均低于miR-552 高表达组，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

表2 miR-552 表达与HCC 患者临床病理特征的关系[n（%）]

68 例HCC 患者按癌组织的miR-383 相对表达量高低，将其分为miR-383 低表达组（miR-383 相对表达量<0.83，n=29）、miR-383 高表达组（miR-383 相对表达量>0.83，n=39）。

miR-383 低表达组与miR-383 高表达组患者的年龄、性别、肝硬化、发生远处转移、发生血管侵袭比例比较，差异无统计学意义（P>0.05）；miR-383 低表达组患者的组织高分化、肿瘤直径≥5 cm、发生淋巴结转移、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期比例均高于miR-383 高表达组，差异有统计学意义（P<0.05）（表3）。

表3 miR-383 表达与HCC 患者临床病理特征的关系[n（%）]

Kaplan-Meier 生存分析显示，HCC 组织中miR-552、miR-383 表达均与患者术后总生存时间相关，生存关系图见图1～2（封三）。68例患者中有5 例患者由于失访等原因导致数据删失，有23 例患者5年后存活。miR-552 低表达组患者的5年生存率为57.7%，高于miR-552 高表达组患者的31.0%，差异有统计学意义（χ2=14.442，P<0.05）。miR-383 低表达组患者的5年生存率为31.0%，低于miR-383 高表达组患者的48.7%，差异有统计学意义（χ2=6.535，P<0.05）。

 

图1 HCC 组织中miR-552 表达与患者术后的生存时间关系

 

图2 HCC 组织中miR-383 表达与患者术后的生存时间关系

将HCC 患者术后5年预后结局作为因变量（否=0，是=1），以差异有统计学意义的HCC 组织中miR-552（低表达=0，高表达=1）、miR-383 表达（低表达=0，高表达=1）的实测值作为自变量进行COX 回归分析，结果显示，miR-552 高表达是影响术后5年不良预后结局的独立危险因素（P<0.05），miR-383 高表达是影响术后5年不良预后结局的独立保护因素 （P<0.05）（表4）。

表4 miR-552、miR-383 表达对HCC 患者5年预后结局的影响

HCC 是临床常见的消化系统恶性肿瘤，目前，其治疗手段主要有局部射频消融治疗、经导管肝动脉化疗栓塞、靶向治疗、外科手术等，但就有效性而言，手术仍是首选的治疗方式[12-14]。但由于HCC 早期症状不明显，确诊时通常已到中晚期，且癌细胞早期易发生侵袭和转移，故患者术后易复发，预后较差，术后5年生存率较低[15-16]。miRNA 是一类内源性非编码小分子RNA，长度为19～25 个核苷酸，通过碱基配对与靶基因mRNA 的3′UTR 区结合，抑制靶基因翻译，可在HCC 侵袭、转移等发生发展过程中发挥作用[17]。王磊等[18]已在研究中发现，HCC 组织中miR-198 表达与患者癌细胞转移能力有关。

miR-552、miR-383 是近年发现的miRNA 家 族成员。洪嵩等[8]研究表明，miR-552 可发挥癌基因的作用，通过靶向抑制Wnt 抑制因子-1 表达，异常激活Wnt/β-catenin 信号通路，促进骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移过程。Wang 等[19]研究表明，miR-552 可通过靶向ADAM28，增强大肠癌细胞转移能力。本研究结果显示，miR-552 在HCC 组织中表达上调，其高表达与组织高分化、肿瘤直径≥5 cm、发生淋巴结转移、发生远处转移、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、发生血管侵袭比例有关（P<0.05），提示miR-552 可能发挥癌基因作用，促进HCC 癌细胞分化、增殖、转移、侵袭。为进一步探究miR-552 在HCC 上的临床价值，本研究分析miR-552 与HCC 患者术后预后的关系，发现miR-552 低表达组患者5年生存率高于miR-552 高表达组患者，差异有统计学意义（P<0.05）；miR-552高表达是影响患者术后5年不良预后结局的独立危险因素（P<0.05），提示miR-552 低表达可能抑制HCC 复发、转移，从而增加5年生存率，改善患者预后结局。

Liu 等[20]研究表明，miR-383 通过抑制caspase-2基因，对人上皮性卵巢癌细胞增殖、细胞周期进程、侵袭过程产生抑制作用。Ma 等[21]研究表明，miR-383 通过靶向内皮PAS 结构域蛋白1 mRNA 并抑制其表达，抑制肺癌细胞株的体外迁移、侵袭过程。本研究结果显示，miR-383 在HCC 组织中表达下调，其低表达与组织高分化、肿瘤直径≥5 cm、发生淋巴结转移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期比例有关（P<0.05），提示miR-383 可能发挥抑癌基因的作用，抑制HCC 癌细胞分化、增殖和转移。本研究分析miR-383 与HCC 患者术后的预后关系，发现miR-383 高表达组患者5年生存率高于miR-383 低表达组患者，差异有统计学意义（P<0.05）；miR-383 高表达是影响患者术后5年不良预后结局的独立保护因素P<0.05），提示miR-383 高表达对HCC复发、转移可能有抑制作用，可能有助于增加5年生存率，改善患者预后结局。

综上所述，miR-552、miR-383 在HCC 组织中分别上调、 下调表达，两者均与HCC 患者组织分化程度、肿瘤直径、淋巴结转移、临床病理、TNM 分期等临床病理特征密切相关，miR-552 高表达、miR-383 低表达可能提示HCC 患者预后不良，对临床应用可能具有一定价值。

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Expression of microRNA-552 and microRNA-383 in hepatocellular carcinoma and their influence on 5-year poor prognostic outcome

ZHAO Juan1 LI Hui2▲ XU Pei-yan2 ZHANG Cheng-fang2 DU Li-jun1 CAO Tian-sheng3
1. Department of Laboratory, Huadu District People′s Hospital of Guangzhou City, Guangdong Province, Guangzhou 501800, China; 2. Department of Internal Medicine, Huadu District People′s Hospital of Guangzhou City, Guangdong Province, Guangzhou 501800, China; 3. Department of Surgery, Huadu District People′s Hospital of Guangzhou City,Guangdong Province, Guangzhou 501800, China

[Abstract] Objective To detect the expression of microRNA-552 (miR-552) and microRNA-383 (miR-383) in hepatocellular carcinoma (HCC) and to investigate the effect of miR-552 and miR-383 on the prognosis of HCC patients.Methods From February 2011 to February 2014, 68 patients with HCC who were hospitalized and underwent radical resection in Huadu District People′s Hospital of Guangzhou City were selected, the HCC tissue of the patients was taken as the study sample, and the adjacent normal tissue(more than 5 cm from the edge of the tumor) was taken as the control sample, the relative expression of miR-552 and miR-383 was detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR). According to the relative expression of miR-552 and miR-383 in HCC tissues, the patients were divided into miR-552 low expression group (miR-552 relative expression <1.28, n=26), miR-552 high expression group (miR-552 relative expression >1.28, n=42), miR-383 low expression group (miR-383 relative expression <0.83, n=29) and miR-383 high expression group (miR-383 relative expression >0.83, n=39). χ2 test was used to analyze the relationship between the expression of miR-552 and miR-383 and the clinicopathological characteristics of HCC. Kaplan-Meier survival curve was used to analyze the factors influencing the prognosis of HCC, and COX regression was used to analyze the factors influencing the 5-year postoperative outcome of HCC. Results The relative expression of miR-552 in HCC tissues was higher than that in adjacent normal tissues, the difference was statistically significant (P<0.05), the relative expression of miR-383 was lower than that in adjacent normal tissues, the difference was statistically significant (P<0.05); comparison of age, gender, the proportion of liver cirrhosis between miR-552 high expression group and miR-552 low expression group, the differences were not statistically significant (P>0.05), while the proportions of high differentiation, tumor diameter ≥5 cm, lymph node metastasis, distant metastasis, TNM stage Ⅲ-Ⅳand vascular invasion in miR-552 low expression group were lower than those in miR-552 high expression group, the differences were statistically significant(P<0.05); comparison of age, gender, proportions of liver cirrhosis, distant metastasis and vascular invasion between miR-383 low expression group and miR-383 high expression group, the differences were not statistically significant (P>0.05), while the proportions of high differentiation, tumor diameter ≥5 cm, lymph node metastasis and TNM stage Ⅲ-Ⅳin miR-383 low expression group were higher than those in miR-383 high expression group, the differences were statistically significant (P<0.05);the 5-year survival rate of miR-552 low expression group was higher than that of miR-552 high expression group, the difference was statistically significant (P<0.05), and the 5-year survival rate of miR-383 low expression group was lower than that of miR-383 high expression group, the difference was statistically significant(P<0.05). The high expression of miR-552 was an independent risk factor for poor prognosis 5 years after surgery (β=0.558, HR=1.748, 95%CI=1.065-2.870, P<0.05). The high expression of miR-383 was an independent protective factor for the poor prognosis 5 years after surgery (β=-0.458, HR=0.634, 95%CI=0.467-0.861, P<0.05). Conclusion The expression of miR-552 and miR-383 in HCC is increased and decreased respectively, both of them are significantly related to 5-year survival rate of HCC patients, which may have some value in judging the prognosis of HCC patients.

[Key words] Hepatocellular carcinoma; microRNA-552; microRNA-383; Prognosis

[中图分类号] R730.261

[文献标识码] A

[文章编号] 1674-4721（2021）7（c）-0023-06

[基金项目]广东省广州市科技计划项目（202002030044）；广东省广州市花都区人民医院院内科研基金项目（2020B03）

[作者简介]赵娟（1984-）女，湖南永州人，硕士，副主任技师，研究方向：优生优育、遗传病诊断，肿瘤遗传等

（收稿日期：2020-12-30）