Article Info

乳腺癌是女性最常见和死亡率较高的恶性肿瘤之一，化疗是乳腺癌综合治疗的重要手段。阿霉素是临床常用的抗肿瘤药物之一，可诱导乳腺肿瘤细胞凋亡来发挥治疗作用，但其治疗肿瘤的机制仍不完全清楚[1]。微小RNA（miR）是在秀丽隐杆线虫中发现的一种内生性RNAs，在细胞分化、增殖、凋亡等过程中发挥重要作用[2-3]。研究表明，miR-21 在乳腺癌组织中表达升高，它通过相关的基因通路的调控，影响相关蛋白表达，与乳腺癌的发生发展密切相关[4]。而乳腺肿瘤细胞凋亡与抑癌基因的表达密切相关。本研究拟通过不同浓度的阿霉素处理人乳腺癌细胞MCF-7 和瞬时转染miR-21 于人乳腺癌细胞系MCF-7 中，通过检测miR-21、磷酸酶及张力蛋白同源物基因（PTEN）和程序性细胞凋亡因子4 基因（PDCD4）的表达，探讨三者的关系及在乳腺癌治疗中的抗肿瘤机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人乳腺癌细胞株MCF-7 购自武汉大学细胞库。细胞用DMEM 培养基（100 μg/mL 青霉素，100 g/L 链霉素）进行培养。细胞置于37℃、5%二氧化碳孵箱中孵育。取对数生长期的细胞，用0.25%胰酶（含0.2%EDTA）消化并传代。

1.2 配制阿霉素试剂及处理细胞

阿霉素购自广东万乐药业有限公司（批号：17092 411），用二甲基亚砜（DMSO）溶解，配制1 mmol/L 的储备液，按2.5、5、10 μmol/L 进行稀释。按浓度梯度向6 孔板里加入阿霉素溶液，24 h 后提取总RNA 及总蛋白。

1.3 CCK-8 法检测阿霉素对MCF-7 细胞的增殖抑制作用

取对数生长期的细胞，调整细胞密度为2×104/mL，接种在96 孔板，加入阿霉素，使药物终浓度为2.5、5、10 μmol/L，每种浓度做3 个复孔，同时设立DMSO组，在细胞培养箱中培养24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8（购自江苏瑞斯生物技术有限公司），继续培养4 h 后，采用酶标仪在450 nm 下检测各组的吸光度（OD）值。

1.4 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测miR-21 的表达

使用takara 公司的RNAiso Plus 按照说明书提取总RNA，使用紫外分光光度计检测纯度。以mRNA 为模板，反转录合成cDNA，按照miScript SYBR Green PCR Kit 说明书加入试剂，引物由大连takara 有限公司合成。miR-21 forward：5′-CGTATGTGAGTCTTCAGC TG-3′，reverse：5′-TITGTCTGAGGGCACAACTC-3′。GAPDH forward：5′-GGAAGTGGGAATCGGAGTC-3′，reverse：5′-GAATAGGGATGTGATGGTTC-3′。进行PCR 扩增，反应条件为95℃，20 s 为1 个循环；95℃20 s，60℃20 s，30 个循环。使用iCycleriQ5（美国BIORAD 公司）实时荧光定量PCR 仪进行检测。

1.5 免疫印迹法（Western Blot）检测目的蛋白PDCD4和PTEN 的表达

使用上海生物工程有限公司生产的单去污裂解液（含PMSF）提取总蛋白，冰上进行。用BCA 试剂盒和酶标仪测量蛋白浓度，使用SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液分装蛋白，将分装的蛋白120℃煮沸5 min。取35 μg 样品加入SDS-PAGE 进行电泳，电泳结束后PVDF 转膜，使用5%的脱脂奶粉封闭2 h 后加入PDCD4（上海生物工程有限公司）和β-actin（上海生物工程有限公司）一抗，1∶1000 稀释，4℃摇床孵育过夜；用TBS-T 缓冲液洗膜3 次，5 min/次，加入二抗（上海生物工程有限公司），1∶2000 稀释，室温摇床孵育2 h；用TBS-T 缓冲液洗膜3 次，5 min/次；曝光，ECL发光试剂盒A 液∶B 液为2∶1 混合后均匀滴在条带上，曝光时间为1 min 30 s，X 线胶片显影，定影。以β-actin为内参，比较不同处理的细胞中PDCD4 蛋白表达水平。PTEN 蛋白表达的检测方法同上。

1.6 miR-21 转染

转染前24 h，将对数增长期MCF-7 细胞以5×105 个/孔接种于6 孔板中。待细胞长至60%～70%汇合时，参照lipofectamine 2000 说明书（购于Invitrogen公司），将终浓度为100 nmol/L 的miR-21 转入MCF-7 细胞。转染结束后，细胞用PBS 洗3 次，然后将6 孔板置于冰上，每孔加入150 μL 蛋白裂解液，裂解完全后收集细胞至1.5 mL EP 管中，离心，取上清液备用。未转染MCF-7 细胞作为对照组，用Western Blot 法检测PDCD4 和PTEN 的表达。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（

±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阿霉素对miR-21 mRNA 表达水平的影响

随着阿霉素浓度升高，miR-21 的mRNA 表达量逐渐降低，5 μmol/L 组、10 μmol/L 组的miR-21 表达量低于DMSO 组，差异有统计学意义（P＜0.05），10 μmol/L组的miR-21 表达量低于5 μmol/L 组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

图1 miR-21 在不同浓度阿霉素处理的MCF－7 细胞中的mRNA 表达

与DMSO 组比较，aP＜0.05；与5 μmol/L 组比较，bP＜0.05

2.2 阿霉素对MCF-7 细胞增殖抑制作用的影响

随着阿霉素浓度的升高，对MCF-7 细胞的抑制率也明显增高。5 μmol/L 组、10 μmol/L 组的细胞存活率低于DMSO 组，差异有统计学意义（P＜0.05），10 μmol/L 组的细胞存活率低于5 μmol/L 组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

图2 CCK-8 试验检测细胞存活率的比较

与DMSO 组比较，aP＜0.05；与5 μmol/L 组比较，bP＜0.05

2.3 阿霉素对miR-21 的目的蛋白PDCD4 和PTEN的影响

随着阿霉素浓度的上升，miR-21 的目的蛋白PDCD4 和PTEN 的表达量逐渐上升，在10 μmol/L 处其表达量最大（图3）。

图3 PDCD4 和PTEN 在不同浓度阿霉素处理的MCF-7 细胞中的蛋白表达

D：DMSO

2.4 转染miR-21 的MCF-7 细胞对PDCD4 和PTEN蛋白的影响

MCF-7 细胞转染miR-21 后，细胞中的PDCD4和PTEN 蛋白的表达量低于对照组（图4）。

图4 PDCD4 和PTEN 在转染miR-21 的MCF-7 细胞中的蛋白表达

3 讨论

miR 是一类内源性小非编码RNA，可特异性识别并结合目标mRNA，促进目标mRNA 的降解或抑制其翻译而负性调控基因的表达，通过多种途径参与恶性肿瘤的发生、发展，在细胞的生长、繁殖、浸润和凋亡中发挥重要的生物学作用，与许多疾病有着枢纽关系。miR-21 即是其中之一，在恶性胶质瘤、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等多种实体肿瘤中发挥着不同程度的促癌作用[5-8]。既往研究表明：①miR-21 在乳腺癌细胞中表达较高，过表达与乳腺癌临床分期晚、淋巴结转移及预后差密切相关[9]；②miR-21 可通过调控PDCD4 蛋白的表达以影响乳腺癌细胞的迁移和侵袭行为[10]；③miR-21 可通过下调抑癌蛋白PTEN 的表达以抑制细胞内甲基化过程从而降低乳腺癌细胞对紫杉醇化疗的敏感性进而影响乳腺癌细胞的恶性行为[11]。阿霉素抑制乳腺癌细胞的增殖能力与miR-21、PDCD4 以及PTEN 的表达水平间的调控关系少有报道。

近年来，随着分子生物学技术的进步，通过对多个乳腺癌相关基因的协同或抑制作用的探讨，有利于为乳腺癌的早期诊断和干预效果提供分子学依据。本研究结果显示，用不同浓度的阿霉素处理MCF-7 细胞后，乳腺癌细胞的存活率明显下降，行RT-PCR 检测出细胞内miR-21 表达逐渐下调，行Western Blot检测出PDCD4、PTEN 蛋白表达的逐渐升高。本研究结果还显示，通过对MCF-7 瞬转miR-21 使其表达升高下调了PDCD4、PTEN 蛋白的表达。刘文新等[12]研究显示，抑制乳腺癌细胞MCF-7 中miR-21 的表达，可以抑制肿瘤细胞的生长增殖。提示miR-21 与PDCD4、PTEN 是相关联的，且呈现负相关，可证明PDCD4 和PTEN 蛋白是miR-21 的靶基因，受miR-21基因调控，通过下调MCF-7 细胞中miR-21 的水平从而上调PDCD4、PTEN 蛋白的表达，可抑制MCF-7 细胞的生长增殖，与Bautista-Sánchez 等[13]的研究结果一致。PDCD4 是凋亡因子家族的成员之一，在多种肿瘤中呈现低表达，其表达的丢失和多种肿瘤的发生和进展相关，包括肾癌、肝癌、乳腺癌、胶质瘤和卵巢癌等[14]。在细胞的凋亡过程中，过度表达的PDCD4 蛋白可以抑制肿瘤的生长[15]。多项研究表明[16-17]，上调PDCD4 的表达，可促进乳腺癌细胞的凋亡，从而发挥抑癌作用。PTEN 是一种抑癌基因，是目前发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，在恶性肿瘤细胞的增殖、分化、浸润和凋亡中起抑制作用[18]。高表达可抑制PI3K/AKT 信号通路激活，Bcl-2 表达显著降低，Caspase-3表达显著升高，诱导乳腺癌细胞凋亡[19-20]。亦有研究表明，PTEN 基因表达可抑制乳腺癌组织内淋巴管的生成，与乳腺癌淋巴结转移、临床分期成负相关，与凋亡指数成正相关[21]。本研究结果提示，PDCD4 和PTEN的表达随着阿霉素浓度的升高而增多，从而抑制MCF-7 细胞的增殖，促进其凋亡，使MCF-7 细胞存活率明显降低。

综上所述，本研究通过从正反两个水平调控MCF-7细胞中miR-21 的表达，发现其与PDCD4、PTEN 蛋白表达水平间的关联。本研究仅仅对miR-21、PDCD4、PTEN 三者间的联系进行了初步探讨，未来将继续围绕MCF-7 细胞中miR-21、PDCD4、PTEN 的表达水平与恶性行为、化疗药物耐药间的关系进行更进一步的研究，为乳腺癌发生发展的分子机制和临床新药治疗靶点提供更多的理论依据。

[参考文献]

[1]Gao J，Zheng Q，Shao Y，et al.CD155 downregulation synergizes with adriamycin to induce breast cancer cell apoptosis[J].Apoptosis，2018，23（9-10）：521-520.

[2]Wang J，Yang M，Li Y，et al.The Role of MicroRNAs in the Chemoresistance of Breast Cancer[J].Drug Dev Res，2014，76（7）：368-374.

[3]LeBlanc VC，Morin P.Exploring miRNA-Associated Signatureswith Diagnostic Relevance in Glioblastoma Multiforme and Breast Cancer Patients[J].J Clin Med，2015，4（8）：1612-1630.

[4]田延龙，高晓，何小岗.miR-21 对乳腺癌MCF-7 细胞增殖、迁移和侵袭行为的影响[J].临床误诊误治，2018，31（9）：69-72.

[5]Lim LP，Lau NC，Garrett-Engele P，et al.Microarrayanalysis shows that some microRNAi downregulate large numbers of target mRNAs[J].Nature，2016，43（7）：769-773.

[6]Volinia S，Calin GA，Liu CG，et al.A microRNA expression signature of human solid tumors d efines cancer gene targets[J].Proc Natl Acad Sci USA，2016，103（7）：2257-2261.

[7]Meng F，Henson R，Wehbe-Janek H，et al.MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer[J].Gastroenterology，2014，133（2）：647-658.

[8]Pan F，Mao H，Deng L，et al.Prognostic andclinicopathological significance of microRNA-21 overexpression inbreast cancer：a meta-analysis[J].Int J Clin Exp Pathol，2014，7（9）：5622-5633.

[9]唐炜，叶熹罡，高进，等.miR-21 及PDCD4 在乳腺癌的表达及预后的关系[J].广州医学院学报，2013，41（2）：33-37.

[10]陈绵龄，马硕一.miR-21 通过靶向PDCD4 调控三阴性乳腺癌细胞的迁移和侵袭[J].癌变畸变突变，2020，32（4）：292-297.

[11]张楹怡，田卫平，梅玫.miR-21 与DNA 甲基化在不同乳腺癌细胞中的相互作用[J].中国应用生理学杂志，2015，31（3）：220-224.

[12]刘文新，李月峰，朱小兰，等.miR-21 对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响[J].江苏医药，2014，40（17）：1998-2001.

[13]Bautista-Sánchez D，Arriaga-Canon C，Pedroza-Torres A，et al.The promising role of miR-21 as a cancer biomarker and its importance in RNA-based therapeutics[J].Mol Ther Nucleic Acids，2020，20（8）：409-418.

[14]吴佳成，陆雅君，姜力.miR-21 下调程序性死亡细胞4对抑制裸鼠肾细胞癌肿瘤转化和增殖的实验研究[J].疑难病杂志，2019，18（1）：61-66，109.

[15]孙娜，杨文燕，张晶晶.PDCD4 在肿瘤进展中的作用及调节机制[J].医学与哲学，2015，36（5）：64-66.

[16]薛茗方，潘峰，王茜，等.姜黄素对乳腺癌细胞株MCF-7中miR-21 的影响及其意义研究[J].中国妇幼保健，2013，28（11）：5186-5188.

[17]Gao G，Liang X，Ma W.Sinomenine restrains breast cancer cells proliferation，migration and invasion via modulation of miR-29/PDCD-4 axis[J].Artif Cells Nanomed Biotechnol，2019，47（1）：3839-3846.

[18]于建斌，李小红.反义抑制微小RNA-21 对程序性细胞坏死因子4 和张力蛋白同源物基因在鳞状细胞癌A431细胞株中表达及细胞凋亡的研究[J].中华实验外科杂志，2013，30（8）：1707-1710.

[18]魏英，赵昌涛，李雨遥.MiR-182 对乳腺癌MCF-7 细胞凋亡及PTEN/PI3K/Akt 通路的影响[J].中国临床药理学杂志，2020，29（10）：12-16.

[20]雷鸣，易朝锋.姜黄素对人乳腺癌MCF-7 细胞凋亡的影响及机制研究[J].临床合理用药，2020，13（10）：163-165.

[21]孙健玮.PTEN 基因与肿瘤相关性的研究进展[J].中国当代医药，2019，26（32）：20-23.