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鲍曼不动杆菌（Ab）是广泛存在自然环境及人体皮肤的重要条件致病菌之一，属于氧化酶阴性非发酵革兰氏阴性杆菌[1]，其临床传播途径主要为接触和空气。近年来，随着临床上免疫抑制剂和广谱抗生素的广泛滥用以及介入性治疗和检查手段在临床上的广泛应用[2]，导致Ab 越来越常见；另一方面，Ab 的环境适应能力非常强，能够在医院环境中长期定植和生存，容易引起手术部位感染、医院获得性肺炎、泌尿系统感染和败血症等相关性感染，导致Ab 成为院内感染的重要病原菌之一[3]。Ab 较高的耐药率和复杂的耐药机制给临床诊治带来了极大的困难和挑战，这已引起了临床学者的高度关注[4]。本研究对深圳市宝安区中心医院分离出的234 株Ab 的病原菌分布、耐药性及耐药基因情况进行统计分析，旨在为临床上感染Ab 的合理治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018年1月～2020年5月深圳市宝安区中心医院住院患者各种标本中分离的234 株Ab 作为研究对象。纳入标准：①首次检出Ab；②由医院感染管理专职人员进行监测和记录；③患者检测前未使抗菌药物；④患者的病案完整；⑤患者对标本采集均知情同意。排除标准：同一患者相同部位分离的重复Ab菌株。本研究项目经医院医学伦理委员会审核批准并实施。

1.2 质控菌株

质控标准菌株为大肠埃希菌（ATCC25922）、Ab（ATCC19606）和铜绿假单胞菌（ATCC27583），标准菌株均由上海复祥生物科技有限公司提供。

1.3 仪器与料材

1.3.1 仪器 ①PCR 扩增仪（型号：MJ Research Opticon2，美国MJ Research 公司）；②双人全排风生物安全柜（型号：BSC-1300IIB2，浙江孚夏医疗科技有限公司）；③微型旋涡混合仪（型号：XW-80A，上海沪西分析仪器厂有限公司）；④台式超速冷冻离心机（型号：BH1200R，上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；⑤台式低速离心机（型号：AG-TG05，上海欧戈电子有限公司）；⑥旋转水浴恒温振荡器（型号：SHZ-82A，江苏金坛富华电器公司）；⑦细菌浊度仪（型号：WGZ-XT，杭州齐威仪器有限公司）；⑧电热恒温培养箱（型号：DHP-9012B，上海一恒科学仪器有限公司）；⑨全自动细菌鉴定分析系统（型号：梅里埃VITEK2 Compact，法国生物梅里埃公司）。

1.3.2 材料将待检菌落制成0.5 麦氏浊度单位（MCF）的菌悬液，Ab 鉴定板使用革兰阴性非发酵板，严格按说明书要求将待检菌悬液加入Ab 鉴定板内，使用35℃电热恒温培养箱孵化24 h，最后采用全自动细菌鉴定分析系统进行鉴定。试剂均使用仪器配套试剂，其检测操作详细步骤均严格按照其说明书进行。

1.4 方法

1.4.1 标本来源送检的临床科室包括：ICU、呼吸内科、全科病房、脑外科、肿瘤科、内分泌科、神经内科、骨科、肾内科、中医科、心内科、普通外科、泌尿外科、消化内科、产科、感染内科、妇科、儿科和康复科。送检的临床标本类型包括：痰液、肺泡灌洗液、脓液、尿液、血液、分泌物、脑脊液、腹水、胸水、气管插管、穿刺液、静脉导管和胆汁。

1.4.2 抗菌药物抗菌药物包括18 种临床常用抗菌药物的药敏纸片（美国赛默飞世尔科技公司）：氨苄西林、头孢曲松、头孢替坦、氨曲南、头孢他啶、环丙沙星、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、妥布霉素、头孢哌酮/舒巴坦、庆大霉素、复方新诺明、左氧氟沙星、氨苄西林/舒巴坦、米诺环素、阿米卡星和多黏菌素B；MH 琼脂血平板购自青岛海博生物技术有限公司，药敏结果的判读参照CLSI 抗菌药物体外敏感性，药敏试验采用纸片扩散法（K-B 法），先将0.5 MCF 的菌悬液接种于MH 琼脂血平板上，接着把各类药敏纸片贴在MH 琼脂血平板上，35℃孵育24 h，试验结果解释参照CLSI 2014 版标准[5]。

1.4.3 耐药基因均采用聚合酶链式反应（PCR）法，其检测的超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）类耐药基因SHV、CTX-M1、CTX-M9、OXA-23、OXA-51、TEM 和ADC基因的PCR 及测序，根据美国生物医学信息中心（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）中已发布的各型耐药基因序列设计引物，SHV、CTX-M1、CTX-M9、OXA-23、OXA-51、TEM 和ADC 耐药基因序列见表1。各型基因PCR 引物及测序由上海生工生物工程有限公司所提供。

表1 耐药基因序列

1.4.4 PCR 反应系体 PCR 反应系体的试剂盒购自上海瑞楚生物科技有限公司，均采用高保真PCR 试剂盒扩增SHV、CTX-M1、CTX-M9、OXA-23、OXA-51、TEM和ADC 的基因片段。Ab DNA 模板提取，取5 个待检Ab菌单个菌落于100 μL 此灭菌双蒸水中磨制成新鲜Ab 菌混悬液，置于95℃煮l0 min，快速冰浴冷却2 min至室温，置于低温高速离心机上使用15 000 r/min 离心10 min，提取上清液即可作为Ab DNA 模板液备用[6]。整体PCR 反应体系总体积为25 μL，其中包括：①2.5 mol/L dNTP 溶液2.5 μL；②10×PCR 缓冲液（含MgCl2）溶液2.5 μL；③2.5 U EX-Taq DNA 聚合酶0.125 μL；④20 μmol/L 引物1 μL；⑤1 μL DNA模板；⑥使用双蒸水补足于25 μL。PCR 反应体系其参数设置如下：①94℃变性30 s；②40℃复性30 s；③72℃延伸60 s。以上一共40 个循环，最后72℃再延伸10 min。获得的实时荧光定量RT-PCR 结果用MJ Research提供的软件进行分析。

1.5 观察指标

①分析比较Ab 菌株各科室感染分布情况；②分析比较Ab 菌株的标本类型情况；③分析比较Ab 的耐药情况；④分析比较Ab 菌株的耐药基因情况。

1.6 统计学方法

细菌耐药数据统计采用世界卫生组织（WHO）提供的软件WHONET 5.6 软件进行统计分析；采用SPSS 12.5 中文统计软件进行数据分析，计数资料以例数或百分比表示。

2 结果

2.1 Ab 菌株的各科室感染分布情况

Ab 菌株主要分布科室以ICU（29.91%，70/234）、呼吸内科（17.9%，42/234）、肾内科（15.0%，35/234）和神经外科（9.8%，23/234）为主，其他科室则为27.41%（64/234）（表2）。

表2 Ab 菌株的各科室感染分布情况（n=234）

2.2 Ab 菌株的标本类型分布情况

Ab 菌株的标本类型以痰液、脓液和腹水为主，分别为：53.00%（124/234），13.25%（31/234）和10.26%（24/234），其他标本为23.49%（55/234）（表3）。

表3 Ab 菌株的标本类型分布情况（n=234）

2.3 各类抗菌药物的耐药情况

Ab 对临床常用抗菌药物广泛耐药，其中氨苄西林、头孢替坦和氨曲南耐药率较高，分别为100.00%、97.86%、95.30%和90.17%；头孢他啶、环丙沙星、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、妥布霉素头孢哌酮/舒巴坦、庆大霉素、复方新诺明、左氧氟沙星、氨苄西林/舒巴坦和米诺环素耐药率次之，分别为73.93%、70.51%、70.09%、69.58%、68.8%、67.09%、63.68%、62.82%、60.26%、56.41%、50.00%和45.30%；阿米卡星和多黏菌素B 耐药率较低，为7.26%和4.70%（表4）。

表4 Ab 对常见抗菌药物的耐药率情况（n=234）

2.4 各类耐药基因的分布情况

耐药基因OXA-51、OXA-23、TEM、CTX-M1、CTXM9、SHV 和ADC 的阳性率分别为79.91%、77.78%、66.67%、55.98%、46.58%、41.88%和35.90%，其中OXA-51 和OXA-23 较高，均超过75%；同携带OXA-23和OXA-51 最高，为64.96%，36.75%同时携带TEM和CTX-M，26.50%同时携带TEM 和SHV，26.50%同时携带OXA-23 和OXA-51（表5）。

表5 Ab 菌株耐药基因的分布情况（n=234）

3 讨论

Ab 是属兼性厌氧非发酵革兰氏阴性杆菌，Ab 广泛存在于自然界，其营养需求比较低，菌体生命力比较顽强，抵抗力强，基本上不能被常规的临床消毒剂消灭[7]；是院内感染中非常重要且常见的条件致病菌，在临床中其分离率仅次于铜绿假单胞菌、不动性革兰氏阴性杆菌[8]，随着侵袭性操作、广谱抗菌药物和免疫抑制剂在世界范围内广泛应用，临床上Ab 耐药趋势日益严重[9]，因此，有必要对Ab 的耐药率进行深入研究。

本研究结果显示，Ab 感染者主要存在于ICU、呼吸内科和肾内科，痰液标本占所有标本的一半左右，提示Ab 主要引起呼吸道感染，Ab 分离率居呼吸道标本第一位，这与张向君等[10]的研究结果基本一致，由于ICU、呼吸内科和肾内科的患者具有免疫功能低下且接受侵入性治疗检查较多的特点，有创机械通气辅助呼吸破坏了原来的皮肤黏膜生理屏障，导致患者免疫力下降，菌群失调，为Ab 的定植、感染创造了条件，Ab 能长期存在于ICU、呼吸内科和肾内科环境中，通过接触及空气传播[11]。本研究中，深圳市宝安区中心医院Ab 的标本分布更集中于痰液标本，占比超过50%，明显高于医院其他科室的占比，分析原因可能为ICU 和呼吸内科患者病情危重，相比其他科室更经常使用呼吸机，留置人工气道和住院时间比较长，Ab 能黏附于呼吸道上皮细胞并形成生物被膜，Ab 对紫外光的抵抗力更强，如经紫外灯消毒的呼吸机等医疗器械物表面仍然可以分离出Ab[12]，这也导致Ab 呼吸道感染剧增。

本研究中，深圳市宝安区中心医院住院患者分离出的Ab 对多数抗菌药物保持高位的耐药率，在50%以上，甚至氨苄西林、头孢替坦和氨曲南的耐药率也超过90%，此研究结果与危群华等[13]报道基本一致，但与欧美国家的研究结果存在差别[14]，提示Ab 的耐药情况在不同的国家、环境和地域等级之间存在一定的差异。本研究结果显示，Ab 对亚胺培南和美罗培南的耐药率也达到60%以上，深圳市宝安区中心医院应对Ab 细菌耐药性进行重点监测，督促相关的科室在临床治疗性使用抗菌药物前应规范进行微生物送检及药敏试验，避免盲目经验性使用抗生素药，临床医生依据药敏实验结果合理选择抗菌药物。近20年来，随着碳青霉烯类和第三、四代的头孢类的抗生素的广泛使用，导致Ab 的抗生素选择性压力明显增大，耐药率节节攀高，甚至在临床上出现泛耐药或者全耐药的菌株[15]，因此，深圳市宝安区中心医院Ab 对临床常用的抗生素均存在严重耐药现象，这提示临床医生必须加强该菌的耐药率检测和合理用药，如遇到严重的Ab 多重耐药菌感染，在对患者对症治疗的同时根据药敏结果联合使用抗菌药物。Ab 耐药机制非常复杂，主要有[16-17]：①Ab 能够产生多种耐药酶，灭活酶和钝化酶；②Ab 的膜蛋白变异，外膜通透性和泵出系统改变；③Ab 抗菌药物的作用靶点基因、质粒介导和整合子变化；④其他原因，如细菌生物膜形成等。

本研究结果显示，Ab 的耐药基因OXA-51、OXA-23、TEM、CTX-M1 和CTX-M9 超过40%，耐药基因SHV 和ADC 也超过30%；Ab 主要是由ESBLs 介导的耐药，TEM 型ESBLs 不同位点的突变可增强Ab对不同头孢菌素类抗生素的灭活能力[18]；OXA-51 内源性获得ISAbal 增强ESBLs 的表达，OXA-23 获得性流动性质粒编码blaNDM-1 碳青霉烯酶基因介导了Ab 对碳青霉烯类抗生素的耐药[19]，本结果研究发现，OXA-23 和OXA-51 耐药基因广泛存在于所有的Ab之中，OXA-23 和OXA-51 耐药基因与碳青霉烯类耐药密切相关。历年来碳青霉烯类抗生素对Ab 的耐药性变化与OXA-23 和OXA-51 的产生呈正相关[9]，产OXA-23 和OXA-51 酶是深圳市宝安区中心医院Ab对碳青霉烯类抗生素产生耐药的主要原因。随着新一代β-内酰胺类抗生素在临床上的大量使用，Ab 产生的β-内酰胺酶也越来越复杂，在多重耐药Ab 中发现了多种β-内酰胺酶，如头孢菌素ADC 型酶、SHV 型酶、CTX-M1 型酶和CTX-M9 型酶等；研究还发现[9]，在Ab 中携带两种以上基因的菌株占比超过70%，Ab同一菌株携带两种耐药基因，是导致本地区Ab 对β-内酰胺类抗生素耐药率高的重要原因之一。

综上所述，深圳市宝安区中心医院Ab 主要分布于ICU 和呼吸内科，分离于痰液、脓液和腹水为主，并且对多种抗菌药物广泛耐药，多数菌株携带耐药基因，携带两种以上基因的菌株占比较高，临床上应加强对耐药Ab 的监测，加强合理用药，控制并遏制耐药菌株的产生。

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