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苦连康肤洗剂是中山市黄圃人民医院与广州中医药大学共同开发的皮肤外用专科制剂，具有清热解毒、燥湿止痒的功效，主要用于湿热所致的湿疮，临床效果显著。清代医家吴师机[1-2]有云“外治非未能见脏腑，皮肤隔而主窍通，不见脏腑而直达脏腑也”，中医认为[3-8]，湿疹病位表浅，病灶外露，外治药物可直达病所，通过透达腠理、疏畅经脉、调和气血、驱邪扶正等机制而发挥局部直接的治疗作用。虽然，中药洗剂外洗治疗小儿湿疹具有历史悠久、疗效独特、使用方便、价格低廉、小儿顺应性强等优势[9-14]，可克服西医常规治疗的各种缺陷。但是，笔者发现，治疗湿疹的诸多中药洗剂存在久置分层严重、pH 值降低明显、指标成分减损明显等药剂稳定性缺陷，文献报道[15-19]提示，质量的有效控制、稳定化措施是重点解决该问题的技术关键。中山市黄圃人民医院与广州中医药大学新药中心携手合作，经研究开发了剂型新颖的混悬型洗液——苦连康肤洗剂。本研究在苦连康肤洗剂质量标准草案的基础上考察苦连康肤洗剂该制剂的初步稳定性，旨在为进一步验证该制剂的工艺合理性、质量可控性提供资料，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AUW220D 电子天平（日本岛津）；Water e2695 高效液相色谱仪（美国沃特世科技公司）；MT-250B 药品稳定性试验箱（施都凯仪器设备有限公司）；S210 pH计（美国METTLER TOLEDO 梅特勒-托利多有限公司）。

1.2 试药及试剂

盐酸小檗碱（批号110713-201212）；苦参碱（批号110805-200508）；黄连对照药材（批号120913-201109）；苦参对照药材（批号121019-201006）；冰片对照药材（批号110743-200905）。以上对照品、对照药材均来自中国食品药品检定研究院。所用药材、乙醇均已全检合格。色谱甲醇购自Merck 公司，水为自制超纯水；其余试剂为分析纯。

苦连康肤洗剂，规格250 mL，批号20190901、20190902、20190903，由中山市黄圃人民医院制剂中心配制。

2 方法与结果

2.1 性状

苦连康肤洗剂为棕黄色黏稠液体，气清香。

2.2 薄层鉴别

采用薄层色谱法（TLC），分别对“1.2”项下的三批苦连康肤洗剂中的黄连、苦参、冰片进行了鉴别，结果显示，特异性强，重现性良好，故列入苦连肤康洗剂标准草案，并以此TLC 法对苦连康肤洗剂进行稳定性考察。

2.2.1 黄连TLC 取苦连康肤洗剂10 mL，加水稀释至30 mL，加氨水调节pH 值至12～13，用乙酸乙酯振摇提取3 次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯2 mL 使溶解，加在中性氧化铝柱（100～200 目，5 g，内径1.0 cm，干法上柱）上，用甲醇10 mL洗脱，收集洗脱液，作为供试品溶液。另取黄连对照药材0.25 g，加甲醇25 ml，超声处理30 min，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液。黄连阴性供试品溶液依照本项的供试品溶液制备方法制备。

按照TLC[《看华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）通则0502]试验[20]57-58，吸取上述三种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺（6∶3∶1.5∶1.5∶1∶0.3）的上层溶液为展开剂，置于用浓氨试液预饱和20 min 的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视，见图1。结果显示，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，Rf 值为0.52。

图1 黄连的TLC 图谱

1.黄连对照药材；2.批号20190901 供试品；3.批号20190902 供试品；4.批号20190903 供试品；5.黄连阴性对照

2.2.2 冰片TLC 取苦连康肤洗剂20 mL，加水稀释至50 mL，用石油醚（60～90℃）振摇提取2 次，每次50 mL，合并石油醚液，挥干，残渣加无水乙醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取冰片对照药材0.1 g，置10 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，作为对照药材溶液。冰片阴性供试品溶液按照本项的供试品溶液制备方法制备。

照TLC（《中国药典》通则0502）试验[20]57-58，吸取上述三种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇（17∶3∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热，至斑点显色清晰，见图2。结果显示，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，Rf 值为0.50。

图2 冰片的TLC 图谱

1.冰片对照药材；2.批号20190901 供试品；3.批号20190902 供试品；4.批号20190903 供试品；5.冰片阴性对照

2.2.3 苦参TLC 取苦连康肤洗剂25 mL，加水稀释至50 mL，用氨水调节pH 值至12～13，用乙酸乙酯振摇提取3 次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加三氯甲烷1 mL 使溶解，取上清液作为供试品溶液。取苦参对照药材0.5 g，加浓氨试液0.3 mL、三氯甲烷25 mL，放置过夜，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷0.5 mL 使溶解，作为对照药材溶液。再取苦参碱对照品，加乙醇制成每1 mL 含有0.2 mg 的溶液，作为对照品溶液。苦参阴性供试品溶液按照本项的供试品溶液制备方法制备。

按照TLC（《中国药典》通则0502）试验[20]57-58，吸取上述四种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇-浓氨试液（4∶5∶2∶1∶0.3）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液，见图3。结果显示，供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，Rf值为0.55。

图3 苦参的TLC 图谱

1.苦参碱对照品；2.苦参对照药材；3.批号20190901 供试品；4.批号20190902 供试品；5.批号20190903 供试品；6.苦参阴性对照

2.3 检查

pH 值依照《中国药典》通则0631 的规定[20]77-78对“1.2”项下三批苦连康肤洗剂进行检查，结果显示，pH值范围均控制在5.0～7.0。

2.4 含量测定

采用反相HPLC 法测定“1.2”项下的三批苦连康肤洗剂成品中的盐酸小檗碱，专属性结果见图4。

图4 盐酸小檗碱HPLC 图谱

A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液

2.4.1 色谱条件Henomenex C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱；以乙腈-0.1%磷酸为流动相（25∶75）；流速为0.8 mL/min；检测波长为345 nm；柱温为25℃。理论板数为10 289，分离度为10，保留时间为19.71 min。

2.4.2 供试品溶液制备取苦连康肤洗剂（批号：20190901）20 mL，加50%乙醇40 mL 溶解，静置，滤过（滤纸片用适量50%乙醇润洗），滤液加在中性氧化铝柱（100～120 目，6 g，内径1.3 cm）上，用甲醇洗脱至洗脱液呈无色，收集洗脱液，用50%乙醇稀释至300 mL，摇匀，0.22 μg 微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.4.3 对照品溶液制备精密称取盐9.05 mg 酸小檗碱，置10 mL 量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，0.22 μg 微孔滤膜滤过，即得对照品溶液。

2.4.4 阴性对照溶液制备取黄连黄柏双阴性样品（20190801）20 mL，同“2.4.2”项的方法制备阴性对照溶液，即得阴性对照溶液。

2.4.4 标准曲线的绘制取盐酸小檗碱对照品适量，精密称取（29.44 mg），置25 mL 量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为盐酸小檗碱对照品贮备液。精密量取盐酸小檗碱贮备液0.20、0.40、0.80、1.00、1.20、1.60、2.00 mL，分别置10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到7 个质量浓度的对照品溶液。按“2.4.1”项下色谱条件分别精密吸取上述对照品溶液各10 μL 注入色谱仪测定，以峰面积积分值为纵坐标（Y），对照品进样质量（μg）为横坐标（X）绘制标准曲线，盐酸小檗碱的回归方程为：Y=4 680 948.054 831X+98 342.500 909（r=0.9999）。结果表明，在0.235 52～2.355 20 μg 范围内，峰面积与盐酸小檗碱的量呈良好的线性关系。

2.4.5 精密度试验精密吸取“2.4.3”项下对照品溶液10 μL，按“2.4.1”项下色谱条件，连续进样6 次，盐酸小檗碱平均峰面积的RSD 为0.95%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.4.6 稳定性试验精密吸取“2.4.2”项下供试品溶液，分别于0、2、4、8、16、24 h 按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，分别测得峰面积，盐酸小檗碱平均峰面积的RSD 为1.56%，表明样品在24 h 内稳定。

2.4.7 重复性试验精密量取盐酸小檗碱对照品贮备液1 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇制得对照品溶液，重复操作6 次，按“2.4.1”项下色谱条件进行试验，分别进样10 μL，测定峰面积，以盐酸小檗碱的含量计算，RSD 为0.75%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.4.8 加样回收率试验精密量取已知含量的20190901批次样品各20 mL，共9 份，分别加入盐酸小檗碱对照品依法制备供试品溶液，测定样品中盐酸小檗碱含量，计算其回收率，平均回收率为100.8%，RSD 为0.84%（n=9）。结果表明，本方法回收率良好，符合定量分析要求。2.4.9 样品测定取“1.2”项下三批样品，按照“2.4.2”项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按“2.4.1”项下色谱条件测定，结果见表1。结果显示，三批样品中盐酸小檗碱的含量分别为0.477 mg/mL（RSD=0.36%）、0.475 mg/mL（RSD=0.24%）、0.474 mg/mL（RSD=0.44%）。

表1 苦连康肤洗剂中盐酸小檗碱的含量

2.5 苦连康肤洗剂的影响因素试验

2.5.1 强光照射试验取“2.4.2”项下的成品适量，置于施都凯药品稳定性试验箱，在照度（4500±500）Lx 条件下，以性状、鉴别、pH 值、含量的变化为指标考察10 d，并在第5、10 天末尾取样检查，作为强光照射试验，结果见表2。

表2 苦连康肤洗剂影响因素的强光照射试验结果

2.5.2 高湿试验取“2.4.2”项下的成品适量，置于施都凯药品稳定性试验箱，在“25℃，RH 为75%”的条件下，以性状、鉴别、pH 值、含量的变化为指标考察10 d，并在第5、10 天末尾取样检查，作为高湿试验，结果见表3。

表3 苦连康肤洗剂影响因素的高湿试验结果

2.5.3 高温试验取“2.4.2”项下的成品适量，置于施都凯药品稳定性试验箱，在“40℃，RH 为65%”的条件下，以性状、鉴别、pH 值、含量的变化为指标考察10 d，并在第5、10 天末尾取样检查，作为高温试验，结果见表4。

表4 苦连康肤洗剂影响因素的高温试验结果

2.3 加速稳定性试验与长期稳定性试验

取“1.2”项下三批中试样品（批号20190901、20190902、20190903），保持上市包装规格，分别置于药品稳定性试验箱中，在规定（T=40℃，RH=25%）条件下考察6 个月，在试验期间第0、1、2、3、6 个月末取样检查，作为加速稳定性考察试验；在规定条件（T=25℃，RH=40%）下考察12 个月，在试验期间第0、3、6、9、12 个月末取样检查，作为长期稳定性考察试验，见表5。结果表明，其性状、鉴别、pH 值、含量等项检查，各项指标均无明显变化。

表5 苦连康肤洗剂加速、长期稳定性试验结果

3 讨论

根据2015年版《中国药典》收载[20]354-356，黄连鉴别的展开剂条件为“环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1）”，多次实验结果表明，应用该展开剂后，其特征斑点的Rf 值超过0.7，且存在阴性干扰。经研究发现“环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺（6∶3∶1.5∶1.5∶1∶0.3）”的上层液为展开剂更适用于黄连特征斑点的鉴定，其Rf 值为0.52。本文还考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸的不同流动相，结果发现选择乙腈-0.1%磷酸基线较平稳，且流速控制在0.8 mL/min 时，指标成分分离度较高，同时为保证目标峰保留时间稳定，控制柱温25℃。本品为液体制剂，包装材料为高密度聚乙烯瓶，属于半透性，故选择“T=40℃，RH=25%”条件下进行加速稳定性考察试验；选择“T=25℃，RH=40%”条件下进行长期稳定性考察试验，由此制定该品种的有效期、选包装材料、明确存储条件，显得更加合理。本项目前期研究已经对防腐剂的种类、用量进行了筛选，并确定了“0.1%羟苯乙酯+0.4 苯甲酸钠”的复配组合防腐剂，但是本文开展加速稳定性试验、长期稳定性试验时，发现本品微生物限度检测中需氧菌总数随着时间的增加而增加，本课题未能及时对试验样品的抑菌效力进行测定，无法进一步阐明防腐剂添加量的合理性，为本文不足之处。

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