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参苏饮为传统中药方剂，始载于《太平惠民合剂局方》，由人参、紫苏叶、葛根、半夏、前胡、茯苓、枳壳、木香、陈皮、甘草、桔梗组成[1]，其中紫苏叶、葛根为君药，前胡、半夏、桔梗、陈皮、枳壳为臣药，人参、茯苓、木香为佐药，甘草为使药，诸药合用，可解表、祛痰、镇咳[2]。除了对慢性支气管炎有良好疗效外，参苏饮临床也被用于治疗气管切开术后的肺部感染[3]，以及小儿反复呼吸道感染[4]。但由于参苏饮成分复杂，活性成分多样，所以其作用机制一直未能得到充分的解释。

慢性支气管炎是由多种因素造成的一种炎症症状[5]，是一种临床常见疾病，发作时间长且治愈率低下。临床多采用抗感染西药进行治疗，但仅局限于对症治疗，难以根治。中药注重调节人体平衡，强调对因治疗，对慢性疾病往往具有良好的疗效。网络药理学涉及药理学、生物信息学等学科，从整体的角度研究药物的药理作用[6]，与中医注重调节整体平衡的治疗特点相吻合，有力地推进了中药现代化。基于此，本研究运用网络药理学技术分析中药方剂参苏饮治疗慢性支气管炎的作用机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 资料收集

中药系统药理学数据库分析平台（TCMSP）（https://tcmspw.com/tcmsp.php，建库至2020年9月），GeneCards数据库（https://www.genecards.org，建库至2020年9月），STRING 11.0 在线分析平台（https://string-db.org），Cytoscape 3.7.0 分析软件，R-4.0.2 语言运行程序，Strawberry Perl 5.32.0 运行程序，Bioconductor 3.12 软件包，UniProt 数据库（https://www.uniprot.org）（建库至2020年9月），基于WEB 的基因富集分析工具集（Webgestalt）（http://www.webgestalt.org）。

1.2 方法

在TCMSP 数据库检索参苏饮中各草药的化学成分。以生物利用度和类药性两个指标进行筛选，生物利用度反映药物成分被人体吸收的程度，数值越高说明该成分被人体吸收的比例越高，类药性与分子的理化性质等相关，反映药物成分被开发成新药可能新的高低，类药性越高说明该成分成为新药的可能越高，一般认为生物利用度大于30%，类药性＞0.18 的成分具有研究价值[7]，故选出生物利用度大于30%，类药性＞0.18 的成分，并且去掉无相关靶点的成分，并获得药物靶点。

在GeneCards 数据库以关键词“chronic bronchitis”检索疾病靶点，与药物靶点对比后得到药物-疾病靶点，以Cytoscape 3.7.0 绘制成分-靶点网络并分析主要活性成分。

将药物-疾病靶点导入STRING 11.0 中，调整相互作用的可信度阈值为0.97 以上并去掉无相互作用的蛋白，得到蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，以R-4.0.2脚本文件获得其中的关键靶点，结果以柱状图显示。

将药物-疾病靶点导入Webgestalt 中进行基因本体论（GO）分析，设置研究物种为人类，P 值调整方法为Benjamini-Hochberg（BH）法，筛选富集程度前15的生物功能，结果以柱形图表示。

以R-4.0.2 语言脚本文件及bioconductor 3.12 相关程序对药物-疾病靶点进行京都基因基因组百科全书（KEGG）分析，设置分析物种为人类，P 值阈值为0.05，筛选富集程度前20 的通路，结果以点图表示。

2 结果

2.1 药物成分与靶点获取

经筛选后，发现中药方剂参苏饮中含有160 种活性成分，药材与相应成分的生物利用度及类药性见表1～8，以上成分对应靶点290 个，与1853 个慢性支气管炎疾病靶点对比绘制Venn 图后得到154 个药物-疾病靶点（图1）。

表1 甘草中活性成分的生物利用度及类药性

表2 人参中活性成分的生物利用度及类药性

表3 紫苏叶中活性成分的生物利用度及类药性

表4 半夏中活性成分的生物利用度及类药性

表5 前胡中活性成分的生物利用度及类药性

表6 葛根和茯苓中活性成分的生物利用度及类药性

表7 枳壳和木香中活性成分的生物利用度及类药性

表8 陈皮和桔梗中活性成分的生物利用度及类药性

图1 参苏饮药物-疾病靶点Venn 图

2.2 药物成分-靶点网络构建

以Cytoscape 3.7.0 软件绘制成分-靶点网络（图2，封三），网络中包含314 个节点以及1823 条相互作用关系，绿色节点为靶点，蓝色节点为成分。以D 值分析网络中的重要活性成分成分节点的D 值表示与该节点相作用的其他节点数量，D 值越大表明与该成分相连的靶点越多，该成分的作用越重要[8]。以软件自带的network analyzer 插件分析发现槲皮素、山柰酚、木犀草素D 值最高，为主要活性成分（图2 圆圈圈出）。

图2 参苏饮治疗慢性支气管炎的成分-靶点网络

2.3 PPI 网络构建

以STRING11.0 做PPI 分析，PPI 网络见图3（封三），PPI 网络中靶点间的连线代表靶点间存在相互作用，连线越粗表明靶点间存在作用的依据越充分，以R脚本文件统计结果文件中各蛋白D 值，D 值表示网络中与此蛋白存在相互作用的蛋白数量，D 值越大表示该蛋白在网络中作用越关键[9]，各蛋白D 值大小情况见图4，分析后发现信号转导与转录激活因子3（STAT3），肿瘤蛋白53（TP53），蛋白激酶B（AKT1），激活蛋白-1 转录因子亚单位（JUN），肿瘤坏死因子（TNF）为关键靶点。图4 中STAT3 与28 个其他蛋白存在相互作用，TP53 为27 个，AKT1 为24个，JUN 为22 个，TNF 为20 个。

图3 参苏饮治疗慢性支气管炎的PPI 网络

图4 PPI 网络中蛋白D 值

2.4 GO 分析及KEGG 分析

GO 分析结果见图5，其中图5M 反映相关靶点主要参与哪些生物过程，图5N 反映相关靶点主要与哪些细胞组成物含量有关，图5P 反映相关靶点与哪些分子功能有关。分析表明，生物过程中富集最高的是炎症反应（inflammatory response），细胞组成中富集最高的是细胞周期依赖性蛋白激酶全酶复合物（cyclindependent protein kinase holoenzyme complex），分子功能中富集前三的是磷酸酶结合（phosphatase binding），激酶调节物活性（kinase regulator activity），细胞因子活性（cytokine activity）。筛选出的药物-疾病靶点与炎症反应等生物过程以及细胞因子，激酶调节等细胞功能密切相关。

图5 GO 分析

M：生物过程，N：细胞组成，P：分子功能

KEGG 分析反映相关靶点主要参与哪些信号通路，结果表明，筛选出的药物-疾病靶点参与了175 个信号通路，图6（封三）为富集排名前20 的通路，主要为TNF 信号通路，并且以上靶点与病毒感染，恶性肿瘤等密切相关，例如人巨细胞病毒感染、EB 病毒感染、膀胱癌等，可见参苏饮治疗慢性支气管炎具有多途径多靶点特性。

图6 KEGG 分析点图

3 讨论

慢性支气管炎本质上为受多种外界因素如病毒细菌等影响所产生的人体炎症反应，本研究以网络药理学方法分析了参苏饮治疗慢性支气管炎的活性成分及作用机制，其中前胡和甘草中的槲皮素，人参和甘草中的山柰酚，紫苏叶和桔梗中的木犀草素为主要活性成分。槲皮素可通过增加Ⅲ型蛋白去乙酰基酶沉默调节因子的表达来抑制基质金属蛋白酶9（MMP9）与基质金属蛋白酶12（MMP12）的合成[10]，从而降低支气管炎症反应。Toll 样受体（TLR）在各种炎症反应中起到重要作用，槲皮素可以通过提高Toll 相互作用蛋白（T-ip）的表达来抑制TLR4 的产生从而减轻炎症反应[11]。MAPK 信号通路参与炎症反应[12]，山柰酚通过抑制TLR4 介导的MAPK 信号通路来抑制流感病毒造成的肺部炎症[13]。JNK/STAT 信号通路的激活可以促进多种炎症因子的合成并加剧炎症反应[14]，有动物实验表明，山柰酚可促进细胞因子信号传导抑制蛋白（SOCO3）的表达来阻断STAT1/3 的信号传导[15]。氧化应激是一种炎症细胞的常见状态，此时细胞释放活性氧（ROS），ROS 又反过来加剧炎症[16]，而木犀草素有一定的还原性，因此可以降低细胞ROS 的含量[17]，相关实验表明，木犀草素可以抑制炎性介质前列腺素的合成[18]，以及一氧化氮合酶的合成[19]，从多方面抑制炎症反应。

STAT3、TP53、AKT1、JUN，TNF 为参苏饮治疗慢性支气管炎的关键靶蛋白，STAT3 参与酪氨酸激酶/信号转导与转录激活因子（JAK/STAT）信号通路，受到上游靶蛋白JAKs 的调节，STAT 可参与人体免疫反应激活，并促进炎症因子的合成，加剧呼吸道炎症反应[20]。TP53 是抑癌基因，在多种肿瘤细胞中存在缺失突变，与肿瘤不良预后及耐药性相关，因此针对TP53 缺失型肿瘤的治疗一直是相关领域的研究热点[21]。AKT1 为AKT 家族亚型，参与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路，与呼吸道炎症及哮喘有关[22]。JUN 与c-Jun 氨基末端激酶/应激活化蛋白激酶（JNK/SAPK）通路相关，该通路为丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的一种，参与了慢性呼吸道炎症的疾病过程，已有研究发现，经过该通路选择性抑制剂处理后的小鼠，其呼吸道中白细胞介素8 等炎症因子的表达水平明显下降[23]。肿瘤坏死因子（TNF）通过其细胞膜受体（TNFR）激活TNF 信号通路，诱导溶酶体缺陷细胞发生不可逆细胞凋亡，同时也参与炎症的发展过程[24]。对TNF 的抑制治疗可以缓解阻塞性肺病中的各种呼吸道炎症反应[25]。

从KEGG 通路分析结果来看，所得的药物-疾病靶点参与了多种病毒细菌感染过程以及癌症的发病过程，这表明炎症与癌症关系密切。生活在炎症微环境中的细胞会有更高的可能性发生突变，例如ROS主要产生于炎性细胞，而该物质会增加DNA 损伤和突变的机会[26]，累积的不利突变最终会导致癌症的发生。一项关于小鼠的研究发现，结肠炎可以通过改变肠道中的微生物环境继而诱发结肠癌[27]，这是肠道内由炎症诱发肿瘤的一种独特机制。

本研究以网络药理学方法对参苏饮对慢性支气管炎的治疗进行了多方面分析，为该药后续研究与应用提供了理论支持。

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