肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是以肺血管阻力进行性升高和右心功能进行性衰竭为主要特征的临床疾病，不可逆损伤肺动脉内皮细胞[1]。现有多种PAH 复制模型，如低氧诱导型、野百合碱型和Ⅱ型骨形成蛋白受体突变型[2-4]，而野百合碱所致PAH 最接近临床，广泛用于动物实验研究。

临床以Ca2+拮抗剂、内皮素受体拮抗剂等肺血管扩张剂治疗PAH，部分患者获益，但价格昂贵。Benza等[5]指出，治疗后PAH 患者3年和5年生存率为68%和57%，仍严重威胁健康。银杏叶提取物（Ginkgo biloba extract，GBE）有抑制炎症、抗肺纤维化等作用[6]。有研究表明，GBE 对延缓PAH 形成有一定作用[7]。本实验探讨不同剂量GBE 对PAH 的作用效果，现报道如下。

野百合碱试剂（sigma 公司）；GBE（德国威玛舒培博士药厂，产品批号4460313，规格：40 mg）；一氧化氮合酶（NOS3）二抗和内皮素-1（ET-1）二抗，均购于Biworld 公司；Dash4000 监护仪；戊巴比妥钠注射液（南开允公药业有限公司）及其他试剂均为国产分析纯试剂。

50 只雄性SD 大鼠[南方医科大学，许可证号：SCXK（粤）2011-0015]，体重180～200 g，依随机数字表分为五组：PAH 模型组（M 组）、正常对照组（C 组）、GBE 低剂量治疗组（G1 组）、GBE 中剂量治疗组（G2组）和GBE 高剂量治疗组（G3 组），每组各10 只，实验前饲养3 d。本研究经相关动物伦理委员会审核同意。

M 组：第1 天脊背部皮下注射1%野百合碱（2∶8乙醇生理盐水溶解）60 mg/kg，第2 天始，每日予2 mL生理盐水灌胃；治疗组（G1、G2、G3 组）：第1 天，1%野百合碱60 mg/kg 脊背部皮下注射，第2 天始，G1 组每日以40 mg/kg GBE 灌胃，G2 组每日以60 mg/kg GBE灌胃，G3 组每日以80 mg/kg GBE 灌胃；C 组：第1 天相等剂量溶媒脊背部皮下注射，第2 天始，每日2 mL生理盐水灌胃。所有SD 大鼠在实验室同等条件饲养21 d。

1.3.1 血流动力学指标的测定 五组SD 大鼠饲养第21 天，禁食过夜，称重，腹腔注射麻醉（3%戊巴比妥钠30 mg/kg）固定，依照孙波等[8]右心导管法游离右侧颈外静脉，置入肝素化聚乙烯软管（外径0.9 mm）并连接Dash4000 监护仪，测定右心房压（RAP）、平均肺动脉压（mPAP）和右心室收缩压（RVSP）并记录分析。

1.3.2 HE 染色和指标测定 放血法处死大鼠并迅速取出心肺组织，生理盐水清洗，右肺中叶及左肺下叶以4%多聚甲醛-PBS 缓冲液固定，固定过夜，石蜡包埋，做4 μm/片连续石蜡切片，HE 染色。剪去心脏的心房、肺动脉和主动脉等组织，剪刀沿室间隔剪去右心室，称取右心室（RV）、室间隔（S）和左心室（LV）重量，计算右心室肥厚指数（RVHI），RVHI=RV/（S+LV），并记录RVHI。

Image-Pro Plus 6.0 病理图像分析系统，测定直径50～150 μm 肺小动脉管壁的内周长和外周长，计算肺小动脉中膜厚度占血管外径百分比（MA%）和血管中层面积与血管总面积比值（MV%）。MA%：（外周长/2π-内周长/2π）/（外周长/2π）×100%；MV%：（外周长2/4π-内周长2/4π）/（外周长2/4π）×100%。每只大鼠测定3 只血管，取平均值。

1.3.3 免疫组化 肺组织石蜡切片常规脱蜡至水，抗原修复，进行ET-1、eNOS 免疫组化染色，通过Image Pro Plus 6.0 图像分析系统进行半定量分析，评分参照Rahman 等[9]的标准。

采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较使用独立样本t 检验，不符合正态分布者转换为正态分布后行统计学分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。

M 组和三个治疗组的RAP、RVSP、mPAP 和RVHI均高于C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；三个治疗组的RAP、RVSP、mPAP 和RVHI 均低于M 组，差异有统计学意义（P<0.05）；三个治疗组间：G3 组的RAP和mPAP 均低于G1 组，差异有统计学意义（P<0.05），其余两两比较，差异无统计学意义（P>0.05）；RVSP 和RVHI 中，G1>G2>G3，但三组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

表1 五组血流动力学和RVHI 的比较（±s）

 

与C 组比较，&P<0.05；与M 组比较，*P<0.05；与G1 组比较，#P<0.05

2.2.1 五组大鼠肺组织病理切片结果 光镜下观察，C组大鼠肺动脉血管内皮细胞扁平且连续，分布均匀，管腔完整，无中断，有完整肺泡腔结构；M 组大鼠肺动脉血管内皮细胞明显肿胀伴脱落，血管平滑肌细胞增生肥大，不规则管腔增厚、狭窄，甚至闭塞，肺泡腔内大量炎性细胞侵润；治疗组大鼠肺动脉血管平滑肌细胞轻度增生，亦可见炎性细胞侵润，管壁厚度介于C 组及M 组之间，三个治疗组肺动脉管腔厚度G1>G2>G3（图1，封三）。

 

图1 五组大鼠肺组织病理切片（HE 染色，200×）

2.2.2 五组大鼠肺动脉重构指标MA%、MV%的比较 大鼠肺动脉重构指标MA%、MV%中，M 组和三个治疗组均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；三个治疗组的MA%和MV%均低于M 组，差异有统计学意义（P<0.05）；三个治疗组的MA%比较，差异无统计学意义（P>0.05）；G3 组与G1 组的MV%比较，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

表2 五组大鼠肺动脉重构指标MA%、MV%的比较（±s）

 

与C 组比较，&P<0.05；与M 组比较，*P<0.05；与G1 组比较，#P<0.05

五组间ET-1 表达高低：M 组>G1 组>G2 组>G3组>C 组，三个治疗组的ET-1 表达均低于M 组，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗组中G3 组的ET-1 表达分别与G1、G2 组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。五组间eNOS 表达高低：C 组>G3 组>G1 组>G2组>M 组，三个治疗组的eNOS 表达均高于M 组，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗组中G3 组的eNOS 表达分别与G1、G2 组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）（图2～3，封三；表3）。

 

图2 ET-1 在五组肺组织中的免疫组化染色（200×）

 

图3 eNOS 在五组肺组织中的免疫组化染色（200×）

表3 五组大鼠ET-1、eNOS 免疫组化评分结果的比较（分，±s）

 

与C 组比较，&P<0.05；与M 组比较，*P<0.05；与G1 组比较，#P<0.05；与G2 组比较，^P<0.05

野百合碱以内皮细胞为靶细胞，不可逆损害肺动脉内皮细胞，与结缔组织相关性PAH 最为相似[3]。肺循环主要阻力血管为直径50～150 μm 的肺小动脉，肺小动脉血管硬化、狭窄导致肺血管阻力增大，引起肺血管重建[10-11]。野百合碱注射1 周后，血管内皮细胞出现损伤，形成增生性肺血管炎、肺循环高压和PAH。本实验中，野百合碱注射3 周后，M 组大鼠RAP、RVSP、mPAP 和RVHI 均高于C 组，病理切片见M 组肺小动脉血管管壁增厚、狭窄，提示PAH 模型成功。

GBE 有抗血小板凝集、抗动脉粥样硬化、抑制新生血管内膜形成、扩张血管和降低血管阻力的作用，GBE可抑制血管内皮生长因子、治疗肺间质纤维化[12-14]；同时有研究证实，GBE 对野百合碱致PAH 有早期保护作用[7]。GBE 3 周治疗后，与M 组比较，G1、G2、G3 组大鼠RAP、mPAH、RVSP、RVHI 和MA%、MV%均下降（P<0.05），提示GBE 治疗后可缓解PAH 进展。三个治疗组间，G3 组的RAP、mPAH 和MV%与G1 组比较，差异有统计学意义（P<0.05），提示低中剂量GEB在延缓PAP 形成效果相似。相比低剂量组，高剂量组在减轻MV%，降低RAP 和mPAH 方面效果更佳，但RVSP、RVHI 和MA%比较，差异无统计学意义（P>0.05），对右心室影响小，可见高剂量组在延缓PAH 和肺动脉重构作用更强，可增强肺血管扩张，有一定剂量依赖，但此需更多研究。

ET-1 为缩血管物质，其有内皮素A 受体（ETAR）和内皮素B 受体（ETBR）两个受体，ETAR 存在于血管平滑肌细胞，可刺激肺动脉血管Ca2+升高，平滑肌细胞收缩，细胞增殖肥大，血管重塑狭窄[15-17]。有研究指出，ET-1 与PAH 的严重程度相关，ET-1 和ETAR表达增高，ETBR 表达降低，可增加ET-1 诱导并促进ETAR 受体增加，使肺动脉血管重建和PAH 进展[18-20]。本研究中，ET-1 表 达：M 组>G1 组>G2 组>G3 组>C组，G1、G2、G3 组ET-1 表达均低于M 组，差异有统计学意义（P<0.05），提示GEB 治疗可降低ET-1 表达，延缓PAP 形成；G3 组的ET-1 表达低于G1、G2 组，差异有统计学意义（P<0.05），提示随着剂量增高，抑制ET-1 表达作用增强。

eNOS 通过NO 生成而发挥舒张血管作用，eNOS为Ca2+和钙调素依赖性酶，促进内皮细胞NO 合成，从而扩张血管、抑制血管平滑肌增殖[21]。实验发现在动脉表面置入NOS 基因支架，可降低管腔狭窄比例和动脉新生内膜面积，减轻血管内膜增厚[22]。如损伤肺动脉内皮细胞，可使eNOS 表达下降，NO 合成减少，扩血管作用减弱，肺动脉血管阻力增加，RVSP 上升，RVHI 加重。本实验在eNOS 免疫组化中，C 组>G 组>M组，提示GBE 可保护和维持内皮细胞，维持eNOS 保证NO 的表达；同时三个治疗组间G3>G1>G2，提示eNOS 对GBE 表现剂量依赖性。

综上所述，野百合碱所致的PAH 模型中，GBR 在PAH 形成的初始阶段可延缓PAH 的进程，其与抑制ET-1 的释放、维持eNOS 的合成有关；虽然低、中剂量GEB 在延缓PAH 过程中无明显差异，但高剂量GEB 治疗可增强延缓PAH 的形成作用，增强对ET-1抑制和eNOS 表达，表现出一定剂量依赖性，但其剂量作用与PAH 形成关系仍需要进一步研究。

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Study on the effect of different doses of Ginkgo biloba extract on monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension

SHEN Tao1 WU Xu2 LU Zhu-ming1
1. Department of Thoracic Surgery, Jiangmen Central Hospital (Jiangmen Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University),Guangdong Province, Jiangmen 529030, China; 2. Department of Surgery, Huiqiao Medical Center, Nanfang Hospital,Southern Medical University, Guangdong Province, Guangzhou 510515, China

[Abstract] Objective To study the effect of different doses of Ginkgo biloba extract (GBE) in monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension, and to measure the expression of endothelin-1 (ET-1) and nitric oxide synthase(eNOS) in lung tissue. Methods According to the random number table method, 50 male SD rats were divide into five groups: normal control group (group C), pulmonary arterial hypertension model group (group M), GBE low-dose treatment group(group G1,40 mg/kg),GBE medium-dose treatment group(group G2,60 mg/kg)and the GBE high-dose treatment group (group G3, 80 mg/kg), 10 rats in each group. The right atrial pressure (RAP), right ventricular systolic pressure (RVSP), mean pulmonary artery pressure (mPAP) and right ventricular hypertrophy index (RVHI) in rats were measured. The histological structure of small pulmonary arteries was observed by HE staining, and the percentage of mesothelial thickness to the outer diameter of the vessel (MA%) and ratio of the mesothelial area to the total area of the vessel (MV%) for 50-150 μm diameter pulmonary arteries were calculated. The expression of ET-1 and eNOS in lung tissue of rats was determined by immunohistochemistry. Results Compared with the group M, the RAP, mPAH, RVSP,RVHI, MA% and MV% of the rats in the three treatment groups decreased, and the differences were statistically significant (P<0.05). Among the three treatment groups, RAP, mPAH and MV% in group G3 were statistically significant compared with group G1 (P<0.05). In eNOS, the expression of eNOS in five groups: group C>group G3>group G1>group G2>group M, the expression levels of eNOS in the three treatment groups were higher than those in the group M, and the differences were statistically significant (P<0.05). The expression of eNOS in the G3 group was compared with the group G1 and group G2, and the differences were statistically significant (P<0.05). In ET-1, the expression of ET-1 in five groups: group M>group G1>group G2>group G3>group C, the expression levels of ET-1 in the three treatment groups were lower than those in the group M, and the differences were statistically significant (P<0.05). The expression of ET-1 in the G3 group was compared with the group G1 and group G2, and the differences were statistically significant (P<0.05). Conclusion GBE can delay the formation of pulmonary arterial hypertension, which is related to inhibiting the release of ET-1 and maintaining the synthesis of eNOS. Compared with low and medium doses, high doses of GEB could enhance the delaying effect formation of pulmonary arterial hypertension in a dose-dependent manner.

[Key words]Ginkgo biloba extract;Monocrotaline;Pulmonary arterial hypertension;Nitric oxide synthase;Endothelin-1

[中图分类号] R285.5

[文献标识码] A

[文章编号] 1674-4721（2021）6（a）-0012-05

（收稿日期：2021-01-22）