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糖尿病为胰岛素分泌不足性疾病，也为临床高血糖性疾病，多数患者为中老年人[1-4]。由于糖尿病的发病机制尚未明确，临床上目前尚未发现特效治疗糖尿病的方法，因此疾病无法有效治愈，患者需长期服用降血糖药物治疗，以控制血糖为主要目标[5-7]。如果用药剂量不当，会对患者的治疗效果带来极大影响，进而出现各种不良反应，还会在一定程度上导致患者产生药抗性，不利于患者的预后效果[8-11]。近年，存在有非法商家向所谓“纯中药”及“保健食品”中非法添加降血糖类化学药物的现象，由于在处方中未标明含有化学药物成分，因此容易令患者忽视并大量长期服用，存在较大的安全隐患，因此有必要建立方法并对这些样品进行检验。检索到有用高效液相色谱法[12-15]、薄层色谱法[16-17]检验此类非法添加样品，但这两种方法专属性不强，灵敏度不高，容易使检验结果不准确；为整顿市场乱象、打击不法份子，本文以丁二胍、格列波脲为分析目标，建立测定这两种非法添加化学药物的超高效液相-串联质谱（UHPLC-MS/MS）法，以期为中成药及保健食品中非法添加丁二胍、格列波脲的检测提供技术依据，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器及试剂

Thermo Vanquish H 型高效液相色谱仪，Xcalibur 3.0.63 工作站（美国Thermo 公司）；Thermo TSQ Quantum Access 型质谱仪，Chromeleon 7.2.10 工作站（美国Thermo 公司）；Sartorius BP211D 型电子天平（德国Sar torius 公司，感量为0.1 mg 和0.01 mg）；Rotina 380R型高速冷冻离心机（美国Hettich 公司）；KQ-500VDV 型台式三频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为500 W，频率为45 kHz）。乙腈为色谱纯（美国Fisher 试剂公司，批号：150941）；水为超纯水，其他试剂为分析纯。

1.2 试药

盐酸丁二胍对照品（日本和光纯药工业株式会社，批号：DPK6533，含量100%）、格列波脲对照品（中国食品药品检定研究院，批号：520026-201401，含量99.9%）；样品分别为：山芪参胶囊（样品编号1，北京阳光一佰生物技术开发有限公司，批号：20120801）、阿尔发仙缘饼干（样品编号2，天津阿尔发保健食品有限公司，批号：2019-07-12）、阿尔发消渴茶（样品编号3，天津阿尔发保健品有限公司，批号：20201015）、百合康牌苦瓜洋参软胶囊（样品编号4，威海百合生物技术股份有限公司，批号：410446001）、蜂之语牌蜂胶软胶囊（样品编号5，杭州蜂之语蜂业股份有限公司，批号：20160927）、夷可舒辅助降血糖胶囊[样品编号6，安发（福建）生物科技有限公司，批号：150304]、消渴丸（样品编号7，广州白云山中一药业有限公司，批号：Z01111）、消渴灵片（样品编号8，吉林省松辽制药有限公司，批号：20190201）、玉泉丸浓缩丸（样品编号9，成都九芝堂金鼎药业有限公司，批号：121103）、降糖甲片（样品编号10，吉林敖东集团金海发药业股份有限公司，批号：141012）。

2 方法与结果

2.1 色谱-质谱条件

2.1.1 色谱条件色谱柱：ACES C18（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱；流动相：0.1%甲酸-10 mmol/L 乙酸铵（A），乙腈（B），梯度洗脱（0～2 min 时90%A，2～2.1 min 时65%A，2.1～4 min 时65% A，4～4.1 min 时60% A，4.1～6.5 min 时60% A，6.5～7 min 时20% A，7～9 min 时20% A，9～9.1 min 时10%A，9.1～12 min 时10%A）；流速：0.3 mL/min；进样量：2 μL；柱温：40℃。

2.1.2 质谱条件电离方式：电喷雾正离子模式（ESI+）；检测方式：选择反应监测（SRM）；雾化气：N2；鞘气流速：30 bar；辅助气流速：10 bar；源电压：4000 V（+）、3500 V（-）；毛细管温度：270℃；定性离子对、定量离子、碰撞能量和离子化模式见表1。

表1 非法添加化学药物的主要质谱参数

*为定量离子

2.2 溶液配制

2.2.1 混合对照品溶液分别取盐酸丁二胍对照品、格列波脲对照品适量，精密称定，用甲醇超声处理，制成浓度为100 μg/mL 的混合对照品贮备液溶液。精密量取上述溶液，用初始流动相（90%A）稀释成含上述物质浓度分别为500 ng/mL 的混合对照品使用溶液。按照“2.1”项下的色谱-质谱条件进样分析，记录SRM色谱图，见图1。

图1 混合对照品溶液的SRM 色谱图

A：丁二胍；B：格列波脲

2.2.2 供试品溶液精密称取样品1 g，置50 mL 量瓶中，加甲醇适量，超声提取15 min，放冷至室温，用甲醇定容至刻度（若样品中含有油脂，则将样品提取液在-20℃条件下放置24～48 h，时间可视样品是否澄清而定），5000 r/min（离心半径10 cm）离心5 min，上清液经微孔滤膜过滤（0.22 μm），取续滤液作为供试品溶液。

2.3 线性关系考察

分别精密量取混合对照品贮备溶液适量，用初试流动相稀释成浓度分别为50、100、200、500、1000、1500、2000 ng/mL 的混合对照品系列溶液，按照“2.1”项下的色谱-质谱条件进样分析，记录SRM 色谱图，以浓度（X，ng/mL）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，结果见表2，由结果可知，各化合物在50～2000 ng/mL 的浓度范围内呈良好的线性关系。

2.4 检测限和定量限考察

分别将“2.3.1”项下的最低浓度溶液用初始流动相继续稀释，进样2 μL，记录SRM 色谱图，以信噪比（S/N）=3 为指标确定检测限，以信噪比（S/N）=10 为指标确定定量限，结果见表2，可见方法的灵敏度完全能够满足非法添加化学药物的检测要求。

表2 非法添加化学药物的回归方程、相关系数、检测限、定量限

2.5 精密度试验

取混合对照品溶液，按照“2.1”项下的色谱-质谱条件，连续进样6 次，记录SRM 色谱图，计算丁二胍、格列波脲的定量离子对质谱峰面积的RSD，结果分别为0.90%、1.17%，说明该方法的精密度良好。

2.6 重复性试验

取阴性样品，加入适量混合对照品储备液，混匀，按“2.2.2”项下供试品的制备方法制备并测定，重复操作6 次，计算丁二胍、格列波脲含量的RSD 值分别为1.11%、2.08%，表明该方法重复性较好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12 h 后进样分析，记录定量离子对SRM 色谱图，计算丁二胍、格列波脲峰面积RSD 值，结果分别为2.58%、1.63%，表明供试品溶液在12 h 内稳定。

2.8 加样回收试验

精密称取阴性样品1 g，分别置于6 个50 mL 量瓶中，分别精密加入混合对照品储备溶液0.25 mL，加甲醇适量，超声提取15 min，放冷至室温，用甲醇定容至刻度（若样品中含有油脂，则将样品提取液在-20℃条件下放置24～48 h，时间可视样品是否澄清而定），5000 r/min（离心半径10 cm）离心5 min，上清液经微孔滤膜过滤（0.22 μm），取续滤液进样分析，5 种化合物的回收率及RSD 值结果见表3，由结果可看出该方法测量准确度良好。

表3 加样回收试验结果（n=6）

2.9 样品测定

从市场收集中成药及保健食品，筛选说明书中“功能主治”或者“保健功能”项下声称有降血糖作用的样品共10 批，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，外标法计算非法添加药品含量，经测定，在10 批样品中（6 批保健食品和4 批中成药），有1 批保健食品中检出非法添加丁二胍，含量为25.33 mg/g，非法添加率为10%，结果见表4，由结果可知现在市场销售的降糖类中成药及保健食品中，确实存在非法添加化学药品现象，有必要建立方法对此类违法行为进行整治。

表4 样品非法添加检测结果

“-”表示未检出

3 讨论

3.1 色谱条件选择

本文考察了乙腈-水、乙腈-醋酸、乙腈-乙酸铵、乙腈-甲酸+乙酸铵等流动相体系，经过考察，采用乙腈-0.1%甲酸+10 mmol/L 乙酸铵为流动相时，各化合物峰型、出峰时间等参数较好，因此确定为最终测定条件。

3.2 质谱条件选择

本试验充分发挥串联质谱检测器专属性强的特点来实现对各化合物的准确检测，因此质谱条件的确立尤为重要。本试验对各组分离子对及碰撞电压进行优化，得到最佳离子响应强度，最终确定了正离子同时扫描的质谱条件，实现了对两种化合物同时分析的目的。

3.3 研究对象的选取

目前针对降糖类中成药及调节血糖类保健食品中非法添加化学药物非法添加检测主要依据国家食品药品监督管理总局所颁布的《药品检验补充方法和检验项目批准件》（批准件编号：2006005、2009029），该标准规定了甲苯磺丁脲、格列本脲、格列齐特、格列吡嗪、格列喹酮、格列美脲、马来酸罗格列酮、瑞格列奈、盐酸吡格列酮、盐酸二甲双胍、盐酸苯乙双胍等11 种化学药品的筛查和验证方法，本文在此标准基础上增加了丁二胍和格列波脲两种化学药品，是对现行标准的良好补充，可为更全面地控制此类产品质量提供有效的科学依据。

3.4 研究的意义

本研究采用甲醇提取，建立了UHPLC-MS/MS 法检测中成药及保健食品中非法添加丁二胍和格列波脲的方法，该方法前处理简单、分析时间短，检出限、精密度和回收率均能满足实验检验工作，可快速、准确地对中成药和保健品中非法添加丁二胍和格列波脲进行测定，提高了日常检验的工作效率，为加强中成药和保健食品市场的监管和检验提供了重要的技术支撑。

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