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流感病毒属于正粘病毒科的RNA病毒，分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型。A型和B型的RNA一共有8个节段，C型为7个节段。8个节段分别编码RNA多聚集酶、血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、核蛋白（NP）、基质蛋白（MP）。和基质蛋白一起构成流感病毒外壳骨架的M2蛋白是一种跨膜蛋白，M2蛋白由97个氨基酸组成，包括N末端的胞外区24个氨基酸残基、跨膜区域19个氨基酸残基、C末端胞质尾54个氨基酸残基[1-2]，N端高度保守，是研究通用流感的重要靶点。但单独的M2基因（M2e）免疫原性很弱，在小鼠中不能引起足够的免疫反应，构建Qβ-M2e病毒颗粒子（virus-like particles，VLPs）融合蛋白，可通过VLPs提高M2e的免疫原性[3]。本研究旨在通过融合表达将M2e抗原表位连接到Qβ噬菌体上，构建Qβ-M2e融合载体（VLP-M2e），并将表达的蛋白免疫小鼠，进行初步的细胞学评价，以建立相关的评价方法[4-5]。

1 材料与方法

1.1 材料

质粒Pet-28a+大肠杆菌E.coli DH5α、BL21（DE3）均由本实验室保存。pET21-Qβ-IRES-Qβ-OVA质粒来自生物物理所侯百东实验室。限制性内切酶为Takara、NEB公司产品，T4 DNA连接酶、CIAP、DNA Marker购自Takara公司。DNA凝胶回收试剂盒购于TransGen公司。所有引物合成和测序由生工生物公司完成。CsCl、酪素购自Amresco，Triton X-114购自Sigma。辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG购自Sigma。ELISA检测试剂盒购自北京万泰。RPMI-1640、FBS、0.5 mol/L EDTA、PBS购于GIBCO公司。1×RBC lysis Buffer购于eBioscience。流式抗体购于Biolegend、BD、eBioscience公司。冷冻切片包埋剂、苏木精染色液购自中杉金桥公司。DAB 4Hcl、Fastred TR salt、Levamisole、Naphthol AS-MX Phosphate、Bio-HRP购自Sigma。α-IgD-Bio购自eBioscience，GL-7-FITC购自BD Bioscience。AP MS&FITC购自Jackson。C57/BL6小鼠来自本实验室饲养（前期购于北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级留种自行繁养）。

1.2 方法

1.2.1 基因合成根据NCBI报道的M2e序列进行比对，设计基因序列，并在两端引进AattⅡ和AgeⅠ两个酶切位点，序列如下：M2E01F：5′-CGGCGGCAGCAG CCTGCTGACCGAAGTGGAAACCCCGATTCGCAACGA ATGGGGCAGCCGCAGCAACGGCAG CAGCGATA-3′；M2E01R：5′-CCGGTATCGCTGCCGTTGCTGCGGCTGCC CCATTCGTTGCGAATCGGGGTTTCCACTTCGGTCAGC AGGCTGCTGCCGCCGACGT-3′。

1.2.2 融合载体构建与鉴定将合成的基因序列M2E01F和M2E01R，稀释至100 μmol/L，进行双链化。反应体系：100 μmol/L的M2E01F 9 μL，100 μmol/L的M2E01R 9 μL，10×anneal Buffer（100 mmol/L Tris 8.0，1 mol/L NaCl，100 mmol/L EDTA）2 μL，瞬时离心混匀。99℃3 min，99～50℃每30 s降0.5℃，获得DS-oligos，浓度为45 μmol/L，梯度稀释至5 nmol/L。PET21-Qβ-IRES-Qβ-OVA质粒DNA经限制性内切酶AattⅡ和AgeⅠ双切后，加入CIAP，37℃30 min，65℃20 min去磷酸化；回收纯化后，同DS-oligos双链，在T4连接酶的作用下将目的基因与载体片段按照3∶1物质的量进行连接，连接产物转化感受态细胞DH5α，挑选经过氨苄青霉素抗性筛选的单克隆菌落，进行酶切鉴定正确的重组质粒，送生工生物有限公司进行鉴定。

1.2.3 融合蛋白的诱导表达及纯化融合载体质粒转化BL21感受态细胞，挑选单克隆，LB活化至OD600=0.5～0.8，离心集菌，弃上清，使用1×M9培养基诱导培养5 h。诱导结束，离心收样，超声破碎，采用Hirachi CR7-2型低速大容量冷冻离心机（日本日立）5000 r/min低速离心10 min、Lynx 4000型号高速离心机（Thermo）20 000 g离心20 min，30%的蔗糖置于离心管底部，加入样品，OPTIMA XPN-100型号超高速离心机（Beckman）200 000 g离心2 h 20 min、24%和50%浓度的CsCl密度梯度200 000 g离心20 h，分层收集纯化样品，1×PBS 4℃透析过夜。SDS-PAGE使用5%的浓缩胶和12%的分离胶。

1.2.4 融合蛋白的电镜检测吸取纯化的样品，滴于碳膜包被的铜网上，在Hello Nanolab 600i型扫描电镜（FEI公司）下观察重组病毒VLPs的组装情况。

1.2.5 融合蛋白的ELISA检测腹腔注射免疫C57/BL6小鼠，免疫融合蛋白剂量25 μg/（0.5 mL/只），对照组小鼠免疫PBS，按照免疫剂量0.5 mL/只，小鼠周龄为8～12周。一针免疫后第14天采血，进行抗体反应检测。VLP-M2E01（3 μg/mL）类病毒颗粒包被酶标板和封闭；依次加入小鼠血清、羊抗鼠IgG-HRP（1:5000稀释），最后以底物TMB显色，450 nm波长测定光吸收（A450）值。

1.2.6 融合蛋白的免疫组化检测OCT包埋新鲜组织块，并迅速冷冻，-80℃保存。使用CM1950型号冷冻切片机（Leica）将冷冻的样品切成7 μm厚的薄片，吸附在载玻片上，丙酮固定10 min，吹干样品，使用TBS-0.1%BSA封闭10 min，加入一抗IgD-Bio、Gl-7-FITC暗盒，4℃过夜。TBS-0.1%BSA洗涤，加二抗FITC-Ab，Bio-HRP，室温1 h，TBS洗涤2遍。IgD显色：使用DAB显色液（含30%H2O2），显色5 min，TBS洗涤2遍。GC显色：使用FastRed显色液，显色30 min，TBS洗涤2遍。细胞核染色：将样品板用ddH2O洗涤，浸泡在苏木精中30 s，在ddH2O中去多余的染色液，浸泡入TBS中至显色，晾干。进行拍照。

1.2.7 融合蛋白的流式细胞检测颈椎脱臼处死免疫组和对照组小鼠，取出新鲜脾脏，同R2缓冲液一起加入40 μmol/L cell strainer中，垂直挤压分离单细胞，并使用Z2 Coulter particle count and size analyzer（BECKMAN COULTER）进行细胞计数。细胞染色：取50～100 μL cell（约含106个细胞），2000 r/min 4℃离心1 min，弃上清，加入50 μL FACS buffer，加入1∶200稀释的流式抗体，缓慢混匀，4℃避光静置30 min；使用FACS buffer洗涤2遍，重悬细胞后，可使用649225型号BD LSRFortessa TM cell Analyzer流式细胞仪（BD）上机检测。细胞单染色抗体：CD4-AF647、IgDpercp-cy5.5、CD38-AF700、B220-PE-CFS94、IgMPE-cy7、CD19-APC-Cy7、B220-PE，单独加入单染色反应孔。细胞表面染色抗体：将Qβ-AF647、IgD-percp-cy5.5、CD38-AF700、B220-PE-CFS94、IgM-PEcy7、CD19-APC-Cy7、Gl-7-PE，混匀后加入每个表面染色反应孔。

2 结果

2.1 融合载体构建与鉴定

酶切检测，PET21-Qβ-IRES-Qβ-M2E01质粒有目的条带，M2E01比OVA序列长，所以PET21-Qβ-IRES-Qβ-M2E01酶切条带大于PET21-Qβ-IRESQβ-OVA（图1）。测序结果比对显示（图2，封三），M2E01的序列同设计的序列一致，载体构建成功。

图1 PET21-Qβ-IRES-Qβ-M2E01质粒KpnI和AgeI双酶切检测结果

M：DNA Marker；1：KpnI和AgeI双酶切PET21-Qβ-IRES-Qβ-OVA；2：KpnI和AgeI双酶切PET21-Qβ-IRES-Qβ-M2E01

图2 PET21-Qβ-IRES-Qβ-M2E01质粒测序结果

2.2 融合蛋白的诱导表达及纯化

PET21-Qβ-IRES-Qβ-M2E01质粒转化BL21感受态后进行诱导表达，5 h有目的蛋白表达，电泳可见清晰条带（图3A，封三）。纯化结果显示，有目的蛋白表达，且目的蛋白Qβ同Qβ-M2e蛋白并非1∶1比例组装，表达产物为Qβ-Qβ和Qβ-M2e颗粒蛋白，两种目的蛋白条带清晰（图3 B，封三）。

图3 VLP-M2e融合蛋白原核表达及蛋白纯化产物的SDS-PAGE分析

（A）VLP-M2e蛋白原核表达产物SDS-PAGE分析。M：Marker；1：VLP-OVA原核表达产物；2：VLP-M2E01原核表达产物；3：阴性对照。（B）VLPM2e蛋白纯化后SDS-PAGE分析。M：Marker；1：融合蛋白（5 μg）；2：融合蛋白（10 μg）

2.3 融合蛋白的电镜检测

质粒PET21-Qβ-IRES-Qβ-M2E01的表达产物VLP-M2e电镜下为空心病毒样颗粒，直径大小约20 nm，病毒颗粒组装完整（图4）。

图4 VLP-M2e颗粒的电镜图（50 000×）

2.4 ELISA检测及免疫组化检测

ELISA检测一针免疫后14 d的小鼠血清，抗体效价为3000，能够引起抗体反应。对照未免疫和免疫融合蛋白的小鼠第14天的脾脏细胞，免疫后的小鼠生发中心（germinal center，GC）染色明显（图5，封四），箭头所指为免疫后小鼠GC B细胞增殖明显。

2.5 流式细胞检测

从总的B细胞中筛选出IgD-IgM-细胞，免疫融合蛋白的小鼠脾细胞中，IgD+细胞有明显的下调过程（图6A1、B1），分析这部分下调的B细胞为GC B细胞，其中一部分为病毒颗粒Qβ+，对照组小鼠的GC B细胞中为病毒颗粒Qβ-，VLP-M2e免疫过后GC B细胞增殖明显（图6A2、B2）。

图6 流式细胞检测结果

A1：对照组小鼠脾细胞中GC B细胞检测结果；A2：对照组小鼠脾细胞中病毒颗粒阳性细胞检测结果；B1：VLP-M2e融合蛋白免疫14 d小鼠脾细胞中GC B细胞检测结果；B2：VLP-M2e融合蛋白免疫14 d小鼠脾细胞病毒颗粒阳性细胞检测结果。

3 讨论

目前世界范围内使用的流感病毒疫苗主要以裂解灭活疫苗、减毒活疫苗为主。但是，由于流感病毒宿主范围广、数量多、共生情况复杂，使得该病毒在进化和传播过程中不断突变，每年都会有不同的流行株出现。通用流感疫苗主要用于预防流感大流行并针对病死率高的流感毒株以降低病死率[6-9]。

自1933年第一株流感病毒被分离以来，所有报道的人类M2e序列高度保守，连接M2e到合适的载体上后，可呈递其免疫原性，并且抗体反应有效[10]，能够完全保护小鼠逃避潜在致死性流感病毒感染。虽然具有免疫原性的表位（M2e）可以通过基因工程方法在机体内得到表达，但由于病原体抗原相对分子质量通常较小，免疫原性低，难以产生足够的免疫反应，外源肽段在机体免疫系统内呈递性弱且小分子肽段在体内容易降解，免疫力持续时间短，单一表位的人群覆盖率低，难以产生广泛的保护性，故重组体病毒成为增加免疫原性的一个很好的突破口。

重组体蛋白是否具有免疫原性及免疫原性的高低主要依赖重组体病毒是否在细胞中自我包装成VLPs及免疫后是否产生引起相应的细胞增殖。Qβ噬菌体是一种RNA噬菌体，利用其衣壳蛋白在大肠杆菌中表达可形成VLPs，将半抗原或抗原表位通过融合表达连接到噬菌体VLPs上，可显著增强其免疫原性。同传统的流感疫苗相比，VLPs疫苗生产周期短，疫苗的产量高[11-16]。

本研究中，Qβ和M2e融合后，通过电镜观察发现融合后仍可以自动装配出VLPs，为增强M2e的免疫原性提供了依据。同时纯化获得的病毒颗粒蛋白在免疫小鼠后能够引起抗体反应及相应的B细胞增殖，为装配后蛋白的有效性提供依据。此外，探索了VLPs免疫后的细胞学评价方法，为流感疫苗的细胞学检测方法的建立提供了依据。

今后实验的目标还可以通过动物模型，继续优化确定VLP-M2e最佳免疫策略，包括免疫的途径、免疫剂量、次数、佐剂的种类等。将人流感病毒HA、NA、NP等基因片段的保守序列分别与M2e融合，建立高表达VLP-M2e-X的表达系统，筛选出具有良好保护效果的通用疫苗。还可以建立免疫组化、流式细胞等细胞学检测结果同动物保护力之间的联系，优化新的评价方法。

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