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动脉粥样硬化（AS）是一种进行性和慢性炎症性疾病，它引起的冠心病、脑卒中和外周血管病等，已成为世界人口死亡的首要原因[1]。由于各种致病因素，血管内皮损伤，氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）积聚于内皮下，触发单核细胞聚集于损伤处并分化为巨噬细胞，后者能够将有毒害作用的ox-LDL吞噬并降解形成泡沫细胞，同时分泌大量炎症因子，刺激细胞凋亡、坏死，细胞清除功能受损，随后形成AS斑块[2]。环状RNA（circRNA）CDR1as已被证明参与多种恶性肿瘤的病理进展，如肝癌[3-4]、肺癌[5-6]和乳腺癌[7-8]。本研究旨在探究CDR1as在巨噬细胞泡沫化过程中的作用，以期为AS发病机制的研究提供新的依据，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 细胞系

RAW264.7小鼠巨噬细胞购自上海中乔新舟生物科技有限公司，置于37℃含5%CO2的培养箱中培养，取对数生长期细胞用于后续实验，所有实验中细胞代数均为3～6代。

1.2 主要试剂

胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司，DMEM购自美国HyClone公司，ox-LDL购自上海翌圣生物科技有限公司，油红O染色液购自北京索莱宝科技有限公司，胆固醇测试盒购自南京建成生物工程研究所和武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，RNA提取试剂盒购自美国OMEGA公司，逆转录试剂盒、SYBR Green Master购自美国Roche公司。

1.3 实验分组及处理

复苏小鼠巨噬细胞，当细胞处于对数生长期时，调整细胞密度为2×105个/孔接种于12孔板后，分为对照组（加入1 mL完全培养基）和不同浓度ox-LDL诱导组（终浓度为25、50、100 μg/mL），培养过夜后根据分组诱导48 h。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 观察细胞内脂质变化使用油红O染色试剂盒进行脂质染色并拍照，根据总胆固醇、游离胆固醇试剂盒说明书进行细胞内胆固醇测定。

1.4.2 检测CDR1as和miR-7a-5p的表达水平并分析两者相关性使用实时荧光定量PCR检测对照组和ox-LDL诱导组中CDR1as、miR-7a-5p表达水平。方法如下：严格按照OMEGA试剂盒说明书进行RNA提取，使用Nanodrop 2000测定总RNA的浓度和纯度（A260/280在1.8～2.2的样本进行逆转录），使用Roche逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。采用SYBR Green染料法进行实时荧光定量PCR检测。引物序列见表1，以β-actin、U6作为内参基因，采用公式2-ΔΔCt计算各样品目的基因的相对表达量。

表1 各基因引物序列

U6引物由广州锐博生物技术有限公司设计合成，序列不公开

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（

±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，采用Pearson相关系数进行相关性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义，以P＜0.01为差异有高度统计学意义。

2 结果

2.1 巨噬细胞泡沫化过程中脂质变化情况

油红O染色显示，与对照组比较，随着ox-LDL诱导浓度的升高，巨噬细胞内脂质增多，细胞泡沫化愈发严重（图1，封三）；同时，巨噬细胞内总胆固醇（TC）、游离胆固醇（FC）以及胆固醇酯（CE）与TC比值（CE/TC）随ox-LDL诱导浓度的增高而增高，差异有统计学意义（图2，P＜0.05）。其中100 μg/mL ox-LDL诱导组中CE/TC＞50%，提示巨噬细胞源性泡沫细胞形成。

图1 油红O染色观察细胞内脂质吞噬情况（×400）

A：对照组；B：25 μg/mL诱导组；C：50 μg/mL诱导组；D：100 μg/mL诱导组

图2 不同浓度ox-LDL诱导组TC、FC含量以及CE/TC比值

与对照组比较，*P＜0.05；与25 μg/mL诱导组比较，#P＜0.05；与50 μg/mL诱导组比较，&P＜0.05

2.2 巨噬细胞泡沫化中CDR1as和miR-7a-5p的相对表达量

CDR1as的表达水平随着ox-LDL诱导浓度的升高而逐渐降低，而miR-7a-5p的表达水平随着ox-LDL诱导浓度的升高而逐渐升高，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3，表2）。

表2 各组细胞CDR1as、miR-7a-5p表达量比较（

±s）

与对照组比较，aP＜0.05；与25 μg/mL诱导组比较，bP＜0.05；与50 μg/mL诱导组比较，cP＜0.05

图3 不同浓度ox-LDL诱导组CDR1as和miR-7a-5p的相对表达量

与对照组比较，aP＜0.05；与25 μg/mL诱导组比较，bP＜0.05；与50 μg/mL诱导组比较，cP＜0.05

2.3 CDR1as和miR-7a-5p的相关性

Pearson分析两者的相关性发现，在巨噬细胞泡沫化过程中CDR1as与miR-7a-5p表达水平具有相关性（r=-0.8876，R2=0.7879，P＜0.01）（图4）。

图4 AS模型中CDR1as和miR-7a-5p表达水平的相关性

3 讨论

AS是多种心脑血管疾病的发病基础，发掘AS诊疗和防治的靶点尤为重要。AS的发病机制十分复杂，许多细胞和分子共同参与了它的病理生理过程，包括内皮细胞、单核-巨噬细胞、血管平滑肌细胞以及炎症细胞和炎症因子等[9]。AS发生的细胞学机制是血管内皮细胞损伤，引起ox-LDL在内皮下积聚，进而触发单核细胞进入动脉壁并分化为巨噬细胞，通过清道夫受体持续摄取ox-LDL，诱导巨噬细胞转化为泡沫细胞，泡沫细胞是AS病变的早期标志，随后逐渐形成脂质条纹和斑块[10]；随着斑块的进展，炎症细胞浸润斑块肩部，导致斑块内广泛的细胞凋亡和坏死，斑块破裂，引发相关心血管事件[11]。作为破裂斑块中的主要细胞成分，巨噬细胞源性泡沫细胞在AS进展中起关键作用。巨噬细胞凋亡、继发性坏死和死亡细胞清除受损被认为是导致斑块从稳定变为不稳定的关键因素[12]。因此，了解这些过程的病理机制可能使我们在AS的临床治疗方面取得新的突破。

近年来，circRNA因其具有高度稳定性、进化保守性和组织特异性，已成为分子生物学领域的研究热点和趋势[13]。circRNA与AS关系十分密切。Wang等[14]发现circRNA在ox-LDL诱导的THP-1巨噬细胞中，可与长链非编码RNA、微RNA和mRNA相互作用共同调控AS中的巨噬细胞泡沫化，形成竞争性内源RNA调控网络。李梦兰等[15]利用细胞实验发现随着ox-LDL诱导THP-1巨噬细胞时间的延长，circDLGAP4的表达呈减少趋势。即泡沫化程度越严重，circDLGAP4表达水平越低，推测circDLGAP4在脂代谢异常导致的AS过程中可能起到了保护作用。

与上述研究类似，本研究采用不同浓度ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化，以模拟AS的进展过程。随着ox-LDL诱导浓度的升高，巨噬细胞内脂质含量增加，细胞泡沫化程度加重，而CDR1as的表达水平逐渐降低，差异有统计学意义（P＜0.05），提示CDR1as表达降低可能预示着AS的疾病进展，其在AS中可能是一种保护性因子。

研究报道，miR-7是CDR1as的一个靶标，具有70多个结合位点[16]。CDR1as作为miR-7分子海绵能够调控其靶基因的表达，参与多种疾病（如胰腺癌[17]、骨肉瘤[18]和心肌梗死[19]）的发生发展。此前有报道称，在以AS为基础的冠心病患者中，无论有无相应临床症状，其外周血中miR-7a-5p表达水平均比健康人高2～3倍[20]。在本研究中，巨噬细胞源性泡沫细胞中miR-7a-5p的表达水平升高，且随ox-LDL诱导浓度以及泡沫化程度的加重而升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。随后，本研究分析了巨噬细胞泡沫化进程中CDR1as和miR-7a-5p表达量的关系，结果表明两者呈负相关，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。以上结果提示CDR1as在AS的病理进程中可能通过海绵miR-7a-5p来发挥生物学作用。然而，CDR1as/miR-7a-5p轴对AS信号通路的调控机制并不清楚，未来还需进一步研究。

综上所述，本研究证明CDR1as与AS的发生发展有关，并初步探索了CDR1as在巨噬细胞源性泡沫细胞中的调控机制，是通过拮抗miR-7a-5p参与病理进展，这不仅为了解巨噬细胞在AS中复杂的生物学功能奠定基础，也为限制巨噬细胞参与的病变形成和发展提供可能的治疗靶点，有助于新的AS防治策略的提出和发展。

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