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鼓膜穿孔在耳鼻咽喉科时有发生，急性、小的穿孔多能在1周～1个月内自发愈合，但慢性鼓膜穿孔或面积较大的穿孔往往需要外科手术来修复[1]。修复穿孔鼓膜主要存在三个问题：①缺乏支架结构；②新生血管生成能力弱和生长因子分泌不足；③细胞外基质的缺乏导致细胞对新膜黏附力弱[2]。目前治疗穿孔的方式主要是鼓膜成形术和鼓室成形术。尽管有各种修补材料可供手术医生选择，例如耳软骨、颞肌筋膜、耳小叶脂肪、耳屏软骨膜等自体材料和透明质酸、胶原蛋白、丝素蛋白、壳聚糖等人工材料，但这些传统移植材料往往只提供机械支撑作用，缺乏促血管生成或细胞增殖作用，因此术后新生鼓膜无法复制天然鼓膜的显微解剖学和振动声学特性[3]。随着组织工程学和再生医学的发展，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）这一新型辅助材料的应用，在鼓膜穿孔治疗中显示出了巨大潜能。

1 MSCs应用的理论依据

干细胞是机体未分化的前体细胞，是体内每个器官和组织形成的基石。根据干细胞的发育阶段，干细胞主要分为两类：①胚胎干细胞即全能干细胞；②成体干细胞。MSCs是一种多能成体干细胞，广泛存在于各种器官和组织中，具有高度增殖、自我更新和多向分化的潜能。1970年，Friedenstein等[4]首次定义MSCs是成纤维细胞集落形成细胞（CFU-F），它们是静止细胞，但在适当刺激下可以增殖分化为各种类型的细胞，如软骨、骨、肌肉细胞、肌腱韧带、成纤维细胞[5]。

创面愈合要经历炎症反应、细胞增殖和组织重塑等不同阶段。创面修复早期，单核巨噬细胞、淋巴细胞等炎症细胞趋化，启动炎症反应。炎症刺激条件下，MSCs可通过分泌转化生长因子-β（TGF-β）、肝细胞生长因子（HGF）等多种蛋白因子，防止细胞免疫或体液免疫中淋巴细胞的过度活化，并在创伤修复过程中产生耐受环境[6]。因此MSCs可以通过免疫调节作用调控炎症反应，降低过度炎症反应造成的组织损伤[7]。MSCs分泌的各种细胞因子和细胞外基质，如血管内皮生长因子（VEGF）、HGF、表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）、基质细胞衍生因子-1（SDF-1）、胰岛素样生长因子（IGF）、TGF-β和血小板源性生长因子（PDGF）等，能够促进细胞存活、细胞增殖迁移和血管生成，从而加速损伤组织修复（表1）。1995年，Lazarus等[8]率先将MSCs作为细胞药物在人类受试者身上进行了测试。MSCs来源广泛，较易从不同的组织中采集，如脂肪组织、脐带血、骨髓和外周血等[9-10]，目前在心血管、骨关节、自身免疫等多种疾病的治疗中均取得良好应用效果[11]。

表1 MSCs分泌的主要生长因子及其功能

2 MSCs在鼓膜再生中的应用

鼓膜的解剖结构由内到外分三层：内黏膜层、含成纤维细胞和胶原的中间纤维层或固有层、角质化鳞状上皮外层[2]。鼓膜功能依赖于其特定的结构，结构改变可能会导致听力受损。鼓膜损伤后，穿孔边缘淋巴、间质液体和血液等渗出并形成液体层，防止鼓膜组织脱水，并帮助细胞迁移。几天内，复层鳞状上皮层增殖，产生的角蛋白向穿孔中心迁移，最终修复穿孔鼓膜。鼓膜的上皮层类似于皮肤的表皮层，但与其他组织不同，由于鼓膜上皮层的生长速度超过纤维层，上皮层越过纤维层与黏膜层相连，因而在鼓膜穿孔自愈过程中，鼓膜纤维层的愈合往往是不完全的、甚至是缺失的[12]，因此寻求一种新型辅助材料促进鼓膜完整再生就至关重要。

2008年，Rahman等[13]使用Sprague-Dawley大鼠进行了一项关于MSCs诱导鼓膜穿孔愈合效应的研究，并评估了新生鼓膜的结构。该研究采用激光切开鼓膜建立急性和慢性大鼠鼓膜穿孔模型，实验组穿孔鼓膜局部注射MSCs悬液，对照组滴入不含MSCs的生理盐水。急性鼓膜穿孔2周后完全闭合。在慢性鼓膜穿孔模型中，经MSCs处理的大鼠穿孔闭合率（40%）高于对照组（10%）。同时用透射电镜观察愈合的鼓膜，证实了鼓膜中存在三层结构。研究还证实，在体外常压和负压下，新生鼓膜的声学振动特性在一定程度上与人鼓膜非常接近，可提供振动特性和高效声透射的重要声学要求。

MSCs介导的鼓膜穿孔愈合的明确机制及其调节方式目前仍不清楚，研究人员仍在调查中。有研究表明，人类鼓膜祖细胞位于鼓膜脐部、鼓环和锤骨柄处，这些部位可能是鼓膜创伤愈合过程中干细胞再生活跃的部位[14]。当动物注射MSCs时，细胞沉积在损伤区域，缺氧环境、Toll样受体配体和细胞因子等局部因素功能性地激活MSCs。这些刺激可以促进MSCs分泌丰富的生长因子，从而促进鼓膜中角质形成细胞的增殖并迁移覆盖穿孔鼓膜[15]。然而，有时在鼓膜穿孔区域直接输送MSCs时，细胞可能会掉入中耳腔，或通过外耳道风干。此外，骨髓基质不同于体内基质，移植的骨髓MSCs需要适当的微环境来促进细胞的存活和增殖，否则，单独使用它们往往不能确保治疗有效性[16]。

3 MSCs联合支架材料在鼓膜再生中的应用

骨髓来源的间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cell，BM-MSCs）具有多潜能、旁分泌和自分泌功能[17]，易于获得，在体外特定培养基下还可分化为多种细胞类型，同时较少引发伦理学关注，因此在细胞治疗、再生医学和组织修复方面展现出广泛的应用前景。迄今为止，大量的动物研究表明，BM-MSCs有助于各种损伤组织的再生，如骨、软骨、血管、心肌和神经组织。有研究表明，单独使用BMMSCs并不能提供令人满意的效果，但当BM-MSCs与支架材料结合时，在治疗鼓膜穿孔方面显示出更好的疗效[18]。

在组织工程中，支架材料被用作支撑结构，为细胞的增殖、迁移和分化提供机械帮助。在鼓膜组织工程中，支架还可作为运送细胞的载体，MSCs可以在选定的支架上适当扩增和分化。基于柔韧性、生物相容性、可降解性、无毒性等特性，许多支架材料如丝素蛋白、明胶海绵、壳聚糖、透明质酸衍生物和海藻酸盐等已经用于鼓膜修补[19]。

透明质酸（hyaluronic acid，HA）是细胞外基质的主要成分，也是目前输送MSCs的最佳可降解生物支架材料之一。Goncalves等[20]的研究证明了植入BMMSCs的HA支架治疗鼓膜穿孔的有效性。在此项研究中，实验组小鼠鼓膜穿孔模型使用嵌入同种异体BM-MSCs的HA支架治疗，对照组未做干预。穿孔后1周，组织学结果显示对照组新生鼓膜上皮层和粘膜层虽清晰可见，但在某些区域却出现中断，而实验组除可见明显上皮层和粘膜层完整覆盖新生鼓膜外，还可见富含细胞外基质的中间纤维层。穿孔后2周，实验组中间纤维层更趋近正常鼓膜，且纤维排列紧密。在此项研究中，MSCs通过分泌营养因子和旁分泌因子，激活干细胞标志物从而刺激穿孔边缘的上皮细胞迁移和增殖，并分化为新鼓膜。HA支架为鼓膜的上皮层增殖提供了所需的结构支持，可以暂时帮助细胞再生，并在愈合过程中或愈合后缓慢地降解。

4 MSCs联合生物打印技术在鼓膜再生中的应用

生物打印技术（bioprinting）诞生于20世纪70年代，是一种能够在数字三维模型辅助下，根据增材制造原理定位装配生物材料或细胞单元，从而制备组织工程支架和组织器官等制品的一种新兴技术[21]。3D生物打印技术可以将细胞精确定值在生物支架上，控制细胞微观排列分布，调节组织工程支架的大小和形状，进而调节细胞与材料的相互作用。20世纪90年代首次被应用于医学领域，目前已被广泛用于组织工程、再生医学以及器官组织重建[22]。

Jang等[23]的一项研究探讨了含有MSCs的聚己内酯/胶原/海藻酸钠（PCAMSC）三维生物打印支架用于封闭亚急性鼓膜穿孔动物模型的可行性。该研究使用雄性Sprague-Dawley大鼠建立亚急性鼓膜穿孔模型。实验组用PCAMSC支架覆盖穿孔，对照组用不含MSCs的PCA覆盖穿孔。耳内窥镜观察，实验组鼓膜在3周内完全闭合（100%），而对照组闭合率仅70%，且两组闭合率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。根据听性脑干反应（ABR）阈值评估，与对照组比较，实验组在所有频率的ABR阈值均恢复到正常水平。光学相干断层扫描（OCT）及光学显微镜显示，PCAMSC治疗组再生鼓膜纤维层和黏膜层增厚，而对照组鼓膜厚度小于实验组。该研究表明，与单独使用PAC支架比较，负载干细胞的PCAMSC支架可以显著提高亚急性鼓膜穿孔的再生能力，并能成功恢复鼓膜声学-力学特性。基于这一结果，笔者认为，PCAMSC生物打印支架可能成为亚急性或慢性鼓膜穿孔的一种新的治疗方法。如今，随着3D生物打印技术的进步，MSCs与支架材料结合可以确保其有效地运送到鼓膜损伤部位，并通过促进损伤部位的细胞增殖和分化来提高穿孔闭合率。3D生物打印技术在组织工程、再生医学和药物开发等方面具有巨大的潜力。然而，面对更加复杂的组织重建，目前的打印技术仍不够先进，细胞大小无法打印、软组织材料打印也存在困难，应用多种干细胞和多种材料的复杂生物打印也还未实现。如果应用于临床，打印速度也有待提高[24]。

5 MSCs应用存在的问题

大量的研究已经证实MSCs对损伤修复的确切疗效。然而，MSCs的应用还存在一些问题。首先，干细胞的分离培养需要规范化。人体的很多组织器官本身存在干细胞，为干细胞的提取和应用提供了广泛的来源，但问题在于如何有效获得足够的干细胞。组织工程中干细胞培养通常采用二维或三维培养基。在二维培养中，贴壁生长方式限制了干细胞增殖，并且无法获得细胞快速增殖及分化所需的一系列条件，细胞培养效率有限。三维培养是使用生物材料构建支架辅助细胞增殖，但是材料来源存在差异，在体外培养往往很难提供相同的培养条件[25]。同时，在体外扩增的过程中，干细胞的特性可能会发生一定程度的改变，使其不再适合受损组织的修复。为了便于不同MSCs研究结果的比较，国际细胞治疗学会于2006年定义了人类MSCs的最低标准：①在标准培养条件下，MSCs必须具有塑料黏附性；②在给定的BM-MSCs群体中，95%以上的细胞表达CD105、CD73和CD90，而CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19和HLAⅡ类表面分子表达不足2%（阳性表达小于2%）；③BM-MSCs在体外标准条件下必须分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞[26]。

另外，要保证干细胞治疗的成功，首先要解决干细胞在移植后的存活及迁移问题。组织损伤后，病变局部的微环境会发生变化，这将对移植后干细胞的存活和迁移造成影响。干细胞移植到应激环境高的部位后，便开始失去适应应激的能力，无法长期存活和增殖。Khasawneh等[27]的一项研究表明低氧条件可能是影响干细胞存活的一个应激条件。干细胞移植后在体内存活率低将直接影响其疗效并限制其应用。因此，保证移植干细胞的归巢、存活及正常迁移是治疗有效的关键。从实验到临床的每一步都需要谨慎评估不断优化，以提高干细胞治疗的效益。

在MSCs移植广泛应用于临床常规治疗前，除了需要大量的基础研究来探索其治疗机制，还需要评估其长期疗效及安全性。有研究报道MSCs可促进肿瘤进展和转移，Amariglio等[28]在2009年报道了1例末端血管扩张症的患者，在接受神经干细胞移植4年后发现脑肿瘤，病理结果显示肿瘤源于所移植的多种异源干细胞。MSCs可能通过以下方式诱导肿瘤发生：①向肿瘤相关成纤维细胞转变；②刺激上皮-间充质转化；③影响肿瘤微环境；④抑制肿瘤细胞凋亡；⑤促进肿瘤细胞转移[15，29]。鉴于MSCs与肿瘤之间复杂的相互作用，尚需更多研究揭示干细胞应用的安全性。

6 结语

综上所述，MSCs是再生医学中一种很有前途的细胞治疗来源。目前MSCs很少用于鼓膜再生，但是有限的研究已经证明了MSCs在治疗鼓膜穿孔方面的有效性。MSCs作为治疗鼓膜穿孔的一种新选择，还需进一步的临床研究来测试其治疗潜力。同时，为了达到稳定的治疗效果，干细胞制备和移植的规范化，包括移植干细胞的数量、给药途径、频率、治疗的最佳时间窗，都需要谨慎评估。

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