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肺炎链球菌是一种能够引起严重的脑膜炎、败血症、大叶性肺炎、支气管炎、鼻窦炎和急性中耳炎等疾病的病原菌，在世界范围内引发很高的发病率和死亡率，可以感染儿童和成人，因此预防和控制肺炎球菌性疾病对人类的健康和生命安全至关重要[1-3]。荚膜多糖（CPS）是肺炎球菌重要的毒力因子，暴露于细菌表面，具有免疫原性，能够诱发宿主的免疫应答反应，因此预防用肺炎链球菌疫苗的生产大多使用肺炎链球菌荚膜多糖[4-6]。为保证多糖疫苗生产批次的均一性和稳定性，合适的菌种保存方法显得至关重要。本研究选择在国内较为常见的肺炎链球菌血清型之一——4型进行研究，通过比较冻干前和冻干后的菌种活性来考察不同保护剂对肺炎链球菌菌种存活率的影响，分析该保护剂下菌种的遗传稳定性以及生长特性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验菌种

肺炎链球菌4型菌种来源于中国医学细菌保藏管理中心（CMCC），编号为31446菌株；肺炎链球菌6A型来源于ATCC，编号为BAA- 659；肺炎链球菌18C型CMCC，编号为 31687；肺炎链球菌19F型CMCC，编号为31692。

1.2 主要试剂及仪器

胰蛋白大豆琼脂、酵母粉、胰蛋白胨、蛋白胨、脱脂奶粉均购自美国BD公司；琼脂粉购自北京奥博星公司；海藻糖、谷氨酸钠均购自国药集团药业股份有限公司；生物安全柜购自苏州安泰空气技术有限公司；二氧化碳培养箱购自力康生物医疗科技控股有限公司；生物显微镜购自奥林巴斯公司；冻干机购自爱德华天利有限公司。

1.3 菌悬液制备

将菌株接种至5%羊血固体培养基，在二氧化碳培养箱中36.5℃、CO2浓度5%～10%条件下复苏培养18～24 h后传代扩增，将铺满固体培养基表面的菌苔刮取至0.85%氯化钠溶液中，混匀，即为菌悬液。

1.4 含不同冻干保护剂的菌悬液制备

根据文献报道[7-10]，选择菌种保藏常用的保护剂成分即A脱脂奶粉、B海藻糖、C谷氨酸钠三种成分为3因素。调整3个水平不同浓度正交试验，正交试验因素水平见表1。

表1 保护剂因素水平表（%）

1.5 冻干工艺

将肺炎链球菌4型菌株在固体培养基传代扩增后菌苔刮至0.85%氯化钠溶液中，制成菌悬液，取各类冻干保护剂各1.5 mL，加入0.5 mL菌悬液，混匀并分装，每种冻干保护剂的菌悬液分装0.2 mL后进行冻干，过程如下。

①预冻：-20℃预冻3 h。②平衡：放置于冻干机中-36℃平衡3 h。③抽真空：0.130～0.180 mbar。④一次升温：缓慢升温至-20℃。⑤干燥：-20℃下保持10 h。⑥二次升温：缓慢升温至15℃。⑦解吸附干燥：15℃下解吸附干燥2 h。⑧制品出柜，真空封口。

1.6 菌种冻干前后活性检测

将菌悬液与0.85%氯化钠溶液按1∶3的比例混匀，制备成菌悬液，将菌悬液按10倍梯度稀释法稀释后涂板，经24 h培养后，检测菌落形成单位（CFU），即冻干前的菌种活性。将含不同冻干保护剂的各组冻干菌种开启，按10倍梯度稀释法稀释后涂板，经24 h培养后，检测CFU计算冻干后的菌种活性。冻干存活率=冻干后的活菌含量/冻干前的活菌含量×100%。对含不同冻干保护剂的各类冻干菌种的冻干存活率进行比较，获得保护效果最佳的冻干保护剂配方。

1.7 菌种冻干前后遗传稳定性检测

荚膜合成位点（cap locus）负责加膜多糖的合成，对该基因簇进行测序分析能为今后肺炎多糖疫苗的生产提供确切的遗传稳定性参考依据。使用primer 5.0软件设计能够覆盖肺炎链球菌4型cap locus全长的特异性引物，然后使用这些引物以冻干后菌种于0、90、180、360 d所取样本为模板进行PCR扩增，分段扩增出其cap locus的DNA片段，然后将这些扩增片段进行核苷酸序列测定，使用SeqMan将测序结果拼接，即可获得相应样本的Cap locus核酸序列全长。使用MegAlign软件对样本Cap locus核酸序列进行同源性分析，通过同源性比对分析来确认样本是否具有遗传稳定性。

1.8 菌种生长特性相关实验

菌种开启后接种在普通营养琼脂培养基上不生长，在含5%羊血固体培养基上生长；35～37℃、5%～10% CO2环境培养形成α溶血、细小圆形、隆起、表面光滑、灰白色、半透明、湿润的菌落，部分呈扁平、中间有凹陷的典型“脐状”菌落。

1.8.1 培养特性分别接种于普通琼脂培养基、普通营养肉水琼脂培养基、5%羊血胰蛋白大豆琼脂培养基上，将各类培养基平板置于35～37℃、5.0%～10.0%CO2环境中培养12～24 h，观察在各种培养基上的生长情况。按10倍梯度稀释法稀释菌液，将稀释菌液涂布接种于5%羊血胰蛋白大豆琼脂培养基上并涂板，将平板置于35～37℃、5.0%～10.0% CO2环境中培养12～24 h，观察菌落形态。进行培养特性观察试验。

1.8.2 奥普托欣试验开启菌种涂布接种于5%羊血胰蛋白大豆琼脂平皿，将3片奥普托欣（Optochin）药敏纸片（5 μg/片）呈三角形状贴于平板上。将平板置于35～37℃、5.0%～10.0% CO2下培养12～24 h，测量抑菌环的直径。

1.8.3 胆汁溶菌试验制备菌悬液。取2支玻璃试管，分别编号为：①、②，2支试管中各加9 mL菌悬液，并在编号为①的试管中加入1 mL 10%脱氧胆酸钠溶液,自然静置；在编号为②的试管中加入1 mL 0.85%氯化钠溶液做对照。将试管置于室温环境中5～30 min，观察结果。

1.8.4 血清学试验取1片干净的玻片，在玻片的一端滴加1滴肺炎链球菌免疫血清，在玻片的另一端滴加1滴0.85%氯化钠溶液作为对照，用接种环钩取少量4型肺炎链球菌CMCC 31446菌株一代菌种的菌苔分别置于玻片上的4型肺炎链球菌免疫血清及0.85%氯化钠溶液液滴中，混匀，轻轻摇动玻片，1～2 min后观察结果。

2 结果

2.1 肺炎链球菌4型菌株冻干前后活性检测

冻干前检测肺炎链球菌4型菌株活性=2.35×108 cfu/mL，对含不同冻干保护剂的冻干菌种的冻干存活率进行检测，冻干后的菌株活性和存活率如表2和图1所示。

表2 肺炎链球菌4型菌株冻干后活性与存活率

图1 肺炎链球菌4型不同保护剂组冻干后存活率柱状分析图

a.10%海藻糖；b.5%海藻糖+5%谷氨酸钠；c.10%谷氨酸钠；d.5%脱脂奶粉+10%海藻糖+5%谷氨酸钠；e.5%脱脂奶粉+5%海藻糖+10%谷氨酸钠；f.5%脱脂奶粉；g.10%脱脂奶粉+10%海藻糖+10%谷氨酸钠；h.10%脱脂奶粉+5%海藻糖；i.10%脱脂奶粉+5%谷氨酸钠

2.2 正交实验分析

根据正交实验结果极差分析（表3）可以看出3个因素对肺炎链球菌4型菌株冻干效果影响的显著性顺序为海藻糖＞脱脂乳粉＞谷氨酸钠，根据正交试验结果可推测：最佳冻干保护剂组合为：5%脱脂奶粉+10%海藻糖+10%谷氨酸钠。

表3 正交实验极差分析表（%）

2.3 最佳冻干保护剂验证

为了验证筛选获得的冻干保护剂配方是否为最优保护剂组合，将推测获得的5%脱脂奶粉+10%海藻糖+10%谷氨酸钠配方应用于肺炎链球菌4型菌株的冷冻真空干燥工艺。经检测冻干后活性为1.90×108 cfu/mL，冻干后存活率达到81.2%，高于前期正交实验中的所有配方组。将该配方应用于6A、18C、19F血清型肺炎链球菌菌株冻干，冻干后存活率分别为82.3%，78.2%和81.2%，均满足生产用菌株的要求。

2.4 肺炎链球菌4型冻干菌株长期存放活率检测

冻干菌种90、180、360 d三个时间节点取样检测活性，计算得到其存活率分别是：80.4%，80.1%和79.8%，说明该配方下的冻干菌株长期存放存活率比较稳定，能够满足生产要求。

2.5 遗传稳定性检测

使用引物以冻干前，冻干后菌种于0、90、180、360 d所取样本为模板进行cap locus DNA片段PCR扩增，扩增产物经测序、拼接获得样本的Cap locus核酸序列全长，最后使用MegAlign软件对样本Cap locus核酸序列进行同源性分析，分析结果显示四个样本之间的同源性均为100%，表明肺炎链球菌4型荚膜合成位点遗传信息稳定性良好。四个样本的同源性分析结果见图2。

图2 肺炎链球菌4型遗传稳定性分析

2.6 菌株生长特性观察

肺炎链球菌4型菌株冻干前后生长特性观察结果如图3～6所示（封三）。研究和分析菌株的培养特性、染色镜检、奥普托欣试验、胆汁溶菌试验、生化反应、血清学试验结果，冻干前、冻干保存360 d后比较，肺炎链球菌4型菌株生长特性无变化（表4）。

表4 生长特性结果的比较

图3 肺炎链球菌4型菌株培养特性观察

图4 肺炎链球菌4型菌株奥普托欣（Optochin）敏感试验

图5 肺炎链球菌4型菌株胆汁溶菌试验

图6 肺炎链球菌4型菌株血清凝集试验

3 讨论

通常情况下采用冷冻真空干燥法对微生物菌种进行保存，但是冷冻真空干燥对菌株有多方面综合胁迫过程，过程中形成的冰晶引起菌体机械损伤、细胞完整性破坏等，导致菌体的存活率降低，影响菌种冻干后的活性[11-14]。

保护剂的加入可改变生物样品冷冻干燥时的物理、化学环境，减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性[15]。冻干保护剂不仅影响冻干过程中的细胞存活率，还影响到保藏期间蛋白质及细胞的稳定性[16]。通过在活菌菌体的冻干过程中加入适宜的保护剂，可以达到减少甚至避免菌体冻干损伤、提高活菌存活率和收率、延长冻干菌株保存期的目的[17]。

本研究以肺炎链球菌4型为冷冻真空干燥试验菌种，通过正交实验以及冻干前后活率分析筛选最佳保护剂配方，最终筛选获得的最佳冻干保护剂配方为5%脱脂奶粉+10%海藻糖+10%谷氨酸钠。该配方下肺炎链球菌血清型4型菌株0 d取样存活率达到81.2%，360 d取样存活率达到79.8%，存活率随着时间推移虽有所下降，但仍符合生产用菌株要求；该配方下菌株同样表现出良好的遗传稳定性以及高度一致的生长特性，表明该冻干保护剂配方适用于肺炎链球菌血清型4型菌种的长期保存。

由于肺炎链球菌血清型较多，目前使用该保护剂进行菌种保存验证的血清型有6A、18C和19F，冻干后菌种存活率分别为82.3%、78.2%和81.2%。对本研究未涉及的菌株保护效果需要进一步确认。另外菌株冻干过程是抵御复杂不良环境胁迫的一个过程，菌株的保藏更是一个长期的过程，需要在长时间保存后，持续对存活率来进行深入的考察，再通过存活率从侧面验证冻干保护剂配方的保护效果。冻干过程除保护剂外其他因素，如冻干曲线等，对菌种长期存放的效果也至关重要，本研究中有所欠缺，需要在后期做进一步探讨与研究。

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