非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）已成为全球最常见的肝病之一，全球约有1/4的成人患有此病，严重型NAFLD可发展为肝硬化、肝衰竭和肝癌等[1-3]。广东省佛山市禅城区中心医院中医专家经多年治疗NAFLD患者的临床经验总结了护肝利湿汤方，由白芍、黄柏、白术、佛手、山药、薏苡仁、茯苓、柴胡等中药组成，具有健脾利湿、疏肝降脂等功效。为方便患者携带和长期服用，将该方制备成煎膏剂（膏方），该剂型与扶正补虚类中药的功效相辅相成，近年来在抗衰老及慢性疾病的康复领域广泛应用[4-8]。然而，目前膏方的煎煮方法无统一标准，其中浸泡时间、煎煮时间、煎煮次数等影响膏方质量的重要因素多凭经验操作，因此所得膏方的质量也因人而异，不利于其推广使用[9-14]。本研究针对护肝利湿膏的煎煮条件进行工艺研究，使用高效液相色谱法（HPLC），以方中白芍主要成分芍药苷及黄柏主要成分小檗碱为指标，筛选护肝利湿膏制备过程中的浸泡时间、加水量、煎煮时间、煎煮次数的最佳参数，为护肝利湿膏煎煮工艺的制定提供依据，现报道如下。

岛津LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；BT25S型电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；微压中药煎煮机（北京东华原医疗设备有限公司）；KQ2200E型超声清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；GZX-9023型电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）。

芍药苷标准品（批号：110736-201842），盐酸小檗碱标准品（批号：120823-201802），均来自中国食品药品检定研究院；水为重蒸水，其他试剂均为色谱纯；护肝利湿膏组方中的白芍、黄柏、白术、佛手、山药、薏苡仁、茯苓、柴胡等中药饮片购自广州至信药业股份有限公司，并经佛山市中药研究会李满联副主任中药师鉴定为正品；护肝利湿膏3批（佛山市禅城区中心医院制备，批号：1010301、1010302、1010303）。

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Amethyst C18-H（4.6 mm×200 mm，5 μm）；检测波长：230 nm；流速：1.0 mL/min；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（每100毫升加十二烷基磺酸钠0.1 g）（14∶86）；进样量：10 μL。

2.1.2 溶液制备

混合对照品溶液的制备：分别精密称定芍药苷、盐酸小檗碱标准品适量，加适量甲醇制成含芍药苷1.504 mg/mL，盐酸小檗碱1.023 mg/mL的混合对照品储备液。

供试品溶液的制备：取护肝利湿膏置烘箱中，待完全干燥后，取出置干燥室冷却干燥至室温，得干浸膏。取约1 g干浸膏，精密称定，放入50 mL容量瓶中，加甲醇定容至50 mL，超声30 min，再次定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.1.3 方法学考察

2.1.3.1 专属性试验 按护肝利湿膏的比例与制备工艺，同法制成不含白芍与黄柏的双阴性样品，精密吸取混合对照品、供试品及阴性样品溶液各10 μL，按2.1.1 项下色谱条件进样。结果表明阴性样品溶液无干扰，方法专属性良好（图1）。

2.1.3.2 线性关系考察 精密量取2.1.2项下混合对照品溶液，加甲醇溶液稀释出5个不同质量浓度的混合对照溶液，按2.1.1项方法进行检测，每个质量浓度平行测定3次，取峰面积平均值。以进样量（μg）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到回归方程分别如下：芍药苷：Y=3455.6X+1486.5（r=0.9991），在0.60～15.042 μg范围内线性关系良好；盐酸小檗碱：Y=6053.2X+121.76，在0.41～3.07 μg范围内线性关系良好。

2.1.3.3 精密度试验 精密量取同一混合对照品溶液，按照2.1.1项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，计算各峰面积的相对标准偏差（RSD），芍药苷、盐酸小檗碱的峰面积RSD分别为0.42%、0.70%，表明仪器精密度良好。

2.1.3.4 稳定性试验 取同一批次样品，按2.1.2项下方法制作供试品溶液，分别于制作后0、2、4、6、8、12 h，按照2.1.1项下色谱条件进样测定，并记录峰面积。芍药苷、盐酸小檗碱的峰面积RSD分别为1.92%、1.43%，显示供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.1.3.5 重复性试验 取同一批次样品，按2.1.2项下方法制备供试品溶液6份，按照2.1.1项下色谱条件进样分析，记录峰面积并计算含量。芍药苷、盐酸小檗碱的平均含量分别为0.99%、0.17%，RSD分别为1.57%、1.55%。

2.1.3.6 加样回收试验 取同一批样品各0.5 g，分别加入已知含量的混合对照品，按2.1.2项下方法制备6份供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件测定，记录峰面积，并计算各峰面积的RSD。芍药苷、盐酸小檗碱的平均加样回收率分别为100.01%、99.7%，RSD分别为3.84%、2.38%，提示该方法回收率良好（表1）。

参考文献[15-16]，按处方比例称取白芍、黄柏、白术、佛手、山药、薏苡仁、茯苓、柴胡等药材9份，每份100 g，在预实验的基础上，选取首次煎煮浸泡时间（A）、加水量（B）、煮沸时间（C）及煎煮次数（D）为影响因素，以芍药苷及盐酸小檗碱含量为指标进行考察，各因素水平见表2，采用L9（34）正交表安排实验，正交设计及正交试验结果见表3，方差分析见表4。

由表2可见，影响煎煮效果的因素顺序为D＞C＞B＞A，即煎煮次数（D）影响最大，加水量（B）、煮沸时间（C）次之，首煎浸泡时间（A）影响最小。故选择偏差平方和最小的首煎浸泡时间为误差项，煎煮次数有统计学意义，表明煎煮次数对煎煮质量影响显著，且煎煮2次时综合评分均值最高。综合分析预测最佳煎煮工艺为A3B2C2D2，即第一煎煮浸泡时间为6 h，加水量为饮片质量的8倍，每次煎煮60 min，共煎煮2次。考虑到生产效率，选取效果接近，耗时更短的方案更合理，建议实际煎煮工艺为A2B2C1D2。

按照优化后的工艺条件进行中试，平行制备3个供试品，测定各指标成分的含量，含量测定结果见表5。芍药苷平均含量14.98 mg/g，RSD值1.26%；小檗碱平均含量3.30 mg/g，RSD值2.19%。优选出的最佳工艺参数重现性好，工艺稳定。

本研究中分别尝试乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸，乙腈-0.1%磷酸（每100毫升添加0.1 g十二烷基磺酸钠）、乙腈-0.1%磷酸（每100毫升添加0.2 g十二烷基磺酸钠）等流动相，结果发现使用乙腈-0.1%磷酸（每100毫升添加0.1 g十二烷基磺酸钠）芍药苷与小檗碱峰型分离度及对称性最好。通过尝试不同波长，发现两个成分峰面积在230 nm处最高，故在此色谱条件下进行。研究曾经尝试测定黄柏碱的含量，但其含量过低，所得色谱峰面积与检测限非常接近，因此不把其纳入质量评价指标。

出膏率曾经是衡量膏方质量的主要标准，但越来越多的研究表明，出膏率受药材质地、含糖量、粉碎程度等影响，并非越高越好，人们更倾向于服用更少的药物来实现同样的治疗效果[17-19]。护肝利湿膏以白芍滋阴平肝，以黄柏清热燥湿，佐以佛手、薏苡仁等健脾利湿，共奏健脾利湿、疏肝降脂之功。因此，本研究以君药白芍与臣药黄柏中的芍药苷与小檗碱的提取率作为膏方的内在质量控制指标。

本研究采用正交试验法优选出护肝利湿膏的最佳煎煮工艺为：首煎浸泡4 h，加8倍量的水，每次煎煮40 min，共煎煮2次。通过研究发现，首次浸泡时间对煎煮质量影响较小，可能与本研究实验部分投料量较少，药材在较短时间内即可完全润透有关。考虑到大规模生产时药材体积较大，水分难以渗透，故应适当延长浸泡时间，有助于有效成分的溶出。当煎煮时间较长时或提取次数到达3次时，有效成分下降，说明有效成分热稳定性较差，因此护肝利湿膏的制备过程应尽量缩短加热时间。然而传统膏方浓缩过程一般采用长时间加热，膏方中的有效成分容易散失，有碍护肝利湿膏质量的进一步提高，需要更深入的研究来解决高温浓缩带来的问题。

综上所述，本研究采用正交设计法，利用HPLC对护肝利湿方中君药和臣药的有效成分进行检测，探究出护肝利湿膏最佳的煎煮工艺，为其他组方煎煮成中药膏方的工艺优化研究提供理论依据。

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Study on decocting technology of Hugan Lishi Ointment

WU Sheng-zhen1 WU Su-zhen2▲ WU Xiang-wei1 Deng Li-chang1
1.Department of Pharmacy,Foshan Chancheng District Central Hospitall,Guangdong Province,Foshan 528031,China;2.Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Foshan Chancheng District Central Hospital,Guangdong Province,Foshan 528031,China

[Abstract]Objective To optimize the decocting technology of Hugan Lishi Ointment.Methods L9(34)orthogonal test method was used with soaking time,water volume,decoction duration and number of times of decoction as the influencing factors.The content of peoniflorin and berberine hydrochloride were taken as the evaluation indices to optimize the decoction process of Hugan Lishi Ointment.Results The optimal extraction conditions were as follows,medicinal materials were soaked for 4 hours before extraction,and extracted with water volume of 8 times of the medicinal materials for two times,40 min each time.Conclusion The optimized decoction technology can provide reference for the production of Hugan Lishi Ointment.

[Key words]Hugan Lishi Ointment;Decoction;Process research;Orthogonal test design

[中图分类号]R283.6

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2021）5（b）-0166-04

[基金项目]广东省佛山市医学类科技攻关项目（2018AB001 141）

[作者简介]吴声振（1971-），男，广东陆丰人，本科，主任中药师，药学部副主任，研究方向：中药学

▲通讯简介：邬素珍（1965-），女，广东梅州人，本科，主任中医师，副院长，研究方向：中医临床

（收稿日期：2020-08-07）