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泌尿系统疾病是指由于变态反应、感染、肾血管病变、代谢异常等引起的尿液异常、尿频、尿急、尿失禁、尿潴留等病理现象的疾病。泌尿系统疾病在中医学上属“淋症”[1]，《金匮要略·消渴小便不利淋病脉证并治》对泌尿系统疾病的描述为“淋之为病，小便如栗状，小腹弦急，痛引脐中”[2]。与西医治疗方法不同，中药治疗泌尿系统疾病不以杀菌为手段，而主要通过“清利湿热”的方法[3-4]。中药既能抑制病原微生物，又能提高人体局部或全身免疫力，改变尿路黏膜局部的内环境[5]。同时，中药中常常使用利尿中药，尿量的增加起到冲刷尿道的作用，可以减少微生物在人体内的停留时间，进一步降低尿路感染的机会[6]。

木通属植物的主要成分为三萜皂苷类、三萜类、酚醇类、酚醇苷类、糖类、氨基酸类等[7]。木通（Akebia Decne）有利尿通淋的功效。金元间医家李杲曾言“小便淋沥或闭塞不通，胫酸脚热，并宜通草主之”[8]。实验证明，木通提取物能有效促进电解质派出，特别是Na+的排出，临床可用于治疗水钠潴留之水肿病症[9]。多种证据证明，木通也具有杀菌消炎、利尿、抗肿瘤等作用[7]。

网络药理学是基于系统生物学的理论，对生物系统进行分析的方法[10]。基于“疾病-靶点-药物”相互作用网络，系统地观察药物对疾病网络的调控，揭示药物协同作用于人体的奥秘[11]。而中药是一个多成分、多靶点、多途径的复杂系统，其思想与网络药理学的核心思想殊途同归[12]。本研究时间为2020年1～4月，旨在从网络药理学角度出发探讨中药木通治疗泌尿系统疾病的活性成分和分子机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 数据库及软件

中药系统药理学分析平台（Traditional Chinese Medicines Systems Pharmacology，TCMSP）[13]；Genecard（https://www.genecards.org/）数据库；OMIM（https://www.omim.org/）数据库；VennDiagram[14]；Cytoscape_3.7.2[15]；STRING 数据库（https://string-db.org/）；Autodock Vina[16]；Metascape 数据库（http://metascape.org）；Chimera（https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/）；Pymol（https://pymol.org/2/）；RCSB PDB（http://www.rcsb.org）；Raccoon（http://autodock.scripps.edu/resources/raccoon）。

1.2 药物活性成分及药物靶点筛选

通过TCMSP 数据库，以“木通”为关键词，检索得到木通的化学成分。以口服利用度（oral availability，OB）≥30%，类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 进行筛选，得到的化合物为药物活性成分。再通过TCMSP，筛选上述结果所对应的靶点，从而得到药物潜在靶点。

1.3 疾病靶点的筛选

通过Genecard、OMIM 数据库分别以疾病名称“泌尿系统疾病（urinary system diseases）”进行检索，将截止至2020年1月24日的筛选结果进行归纳，得到疾病相关的靶点。

1.4 交集靶点的获取及活性成分-作用靶点网络构建

按“1.2”项的条件筛选得到的药物潜在靶点，与按“1.3”项的条件筛选得到的疾病靶点进行取交集的操作，利用R 语言软件VennDiagram 构建韦恩图。将交集的靶点和药物的活性成分导入Cytoscape，绘制活性成分-作用靶点网络。

1.5 蛋白质相互作用网络（PPI）的构建

将按“1.4”项的条件筛选得到的靶点输入STRING数据库，选择“multiple proteins”模式，蛋白种属设“Home sapiens”，筛选条件为最低相互作用阈值取“high coffidence（0.700）”。建立药物靶蛋白-疾病靶蛋白（PPI）相互作用网络。之后将STRING 平台分析得到的相互作用蛋白基因输入Cytoscape 中的Biso-Genet 插件中，筛选条件为Identifiers 下选择“Homo sapiens（Human）” “Gene identifiers only”，Data Settings下只选择“Protein Protein Interaction”，准备下一步的蛋白质拓扑分析。

1.6 PPI 拓扑网络分析和核心靶点筛选

使用Cytoscape 插件CytoNCA 进行拓扑分析，以度中心性（degree centrality，DC）、中间中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）这三个参数对网络进行分析，这三个数值是评价网络中“节点（Node）”重要性的参数。参数的值越高，说明节点在网络中越重要[17]。第一次筛选以DC 大于其两倍中位数作为指标，第二次以BC、CC 大于其中位数作为指标，筛选得到核心靶点，生成新的PPI 网络[18]。

1.7 分子对接

采用Autodock-Vina，从RCSB PDB 数据库上将转录因子AP-1 蛋白（JUN）、毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1 蛋白（CHRM1）、5-羟色胺受体2（HTR2A）、糖皮质激素受体蛋白（NR3C1）、热休克蛋白HSP90-β（HSP90AB1）下载后，去除水分子，加极性氢，并加上Kollman charges。定义好Grid box 后导出为pdbqt.格式。再利用Raccoon 软件将8 个小分子化合物转成pdbqt.格式。将JUN、CHRM1、HTR2A、NR3C1、HSP90AB1 与活性成分-靶点网络图中每个靶点对应的小分子进行分子对接。

1.8 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析

将上述“1.6”项的条件筛选的PPI 网络核心靶标导入Metascape 中，进行基因本体论（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。物种选择“H.sapiens”“P-value”选择0.01。选取KEGG 通路和GO 通路的各前20 条进行分析。

2 结果

2.1 木通活性成分及潜在药物靶点

通过TCMSP 检索“木通”得到的木通活性成分有43 种，以OB≥30%、DL≥0.18 所得到的化学成分有8种，分别为：马兜铃酸BⅡ甲酯（ariskanin A，OB：109.51%，DL：0.40）、马兜铃酸A（aristolochic acid A，OB：62.71%，DL：0.55）、马兜铃酸Ⅱ（aristolochic acid Ⅱ，OB：37.56%，DL：0.45）、豆甾醇（stigmasterol，OB：43.83，DL：0.76）、β-谷甾醇（β-sitosterol，OB：36.91，DL：0.75）、马兜铃苷（aristoloside_qt，OB：40.32，DL：0.60）、poriferast-5-en-3β-ol（OB：36.91，DL：0.75）、常春藤皂苷元（hederagenin，OB：36.91，DL：0.75）。与上述8 个化合物所对应的靶点有60 个（去除重复），结果见表1。

表1 木通部分药物靶点信息

（续表）

2.2 疾病靶点的筛选

通过Genecard，以“urinary system diseases”为关键词，检索得到疾病靶标9574 个。通过OMIM，仍以“urinary system diseases”为关键词进行检索，得到结果363 个，经过去重，共得到疾病靶点9584 个。

将9584 个疾病靶点与60 个药物靶点通过R 语言包VennDiagram 构建韦恩图（图1）。交集靶点有51 个。

图1 药物靶点-疾病靶点韦恩图

图中大圆圈表示泌尿系统疾病相关靶点，小圆圈表示木通中小分子成份对应的靶点。通过韦恩图可以得到中药中有效成份对应靶点与泌尿系统疾病相关靶点的交集，从而推测木通中的小分子化合物可能通过与交集靶点发生相互作用来起到治疗作用

2.3 药物靶点与疾病靶点标准化及活性成分-靶点网络图构建

交集靶点，主要涉及到前列腺素-内过氧化物合酶1（PTGS1）、凝血因子Ⅶ（F7）、维甲酸X 受体α（RXRA）、热休克蛋白90α 家族B 成员1（HSP90AB1）等。将交集靶点、药物活性成分导入Cytoscape，构建活性成分-作用靶点网络图（图2）。

图2 活性成分-靶点网络

左边六边形表示木通中的小分子活性成份，圆圈表示中药木通，三角形表示靶点，右边六边形表示泌尿系统疾病。中药木通（Akebia Stem）发出的线段表示木通中根据OB 和DL 值筛选出来的有效成份，泌尿系统疾病（urinary system diseases）发出的线段表示与泌尿系统疾病相关的靶点。左边六边形与三角形之间的线段表示中药中的有效成分能与靶点之间发生相互作用。通过活性成份-靶点网络图可知木通中含有哪些有效成份，以及这些有效成份分别是通过调控哪些靶点来起到治疗作用

2.4 PPI 网络构建和拓扑分析

将“2.3”项的得到的交集靶点，按“1.5”项的条件导入STRING 平台，构建蛋白质相互作用网络（PPI）（图3）。

图3 共有靶点PPI 网络

通过构建药物靶点与疾病靶点的PPI 网络，可以得到交集靶点的相关靶点，方便下一步的通路分析

为进一步探究木通治疗泌尿系统疾病的药理机制。将共有蛋白基因输入Cytoscape 的Bisogenet 插件中，进行拓扑分析网络。再用CytoNCA 插件对该网络进行筛选。按“1.6”项的条件，第一次按degree 值两倍进行筛选，得到一个2407 个点，50 137 条边的网络。再以大于BC 值，CC 值中位数作为条件，最终得到一个172 个点，5381 条边的PPI 网络图。其筛选过程见图4（封四）。

2.5 分子对接及结合自由能分析

为了验证木通有效成分与相关靶标关系，本研究选择了“2.4”项中PPI 网络拓扑分析得到的核心靶蛋白中与木通活性成分直接作用的核心靶标HSP90AB1 和JUN，以及“2.4”中共有靶点PPI 网络中degree 值排名前四的靶标JUN、CHRM1、HTR2A、NR3C1 进行分子对接验证。

通过活性成分-靶点网络图，发现与HSP90AB1直接作用的化合物是马兜铃酸BⅡ甲酯（ariskanin A）和β-谷甾醇（β-sitosterol）。与JUN 相互作用的化合物是β-谷甾醇（β-sitosterol）。与CHRM1 相互作用的是豆甾醇（stigmasterol）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、常春藤皂苷元（hederagenin）。与HTR2A 相互作用的是豆甾醇（stigmasterol）、β-谷甾醇（β-sitosterol）。与NR3C1 相互作用的是马兜铃酸A（aristolochic acid A）、马兜铃苷（aristoloside_qt）、马兜铃酸BⅡ甲酯（ariskanin A）。将每个靶点与对应的化合物分别进行分子对接。

从RCSB PDB 上下载蛋白，用Chimera 去除配体和水分子。从TCMSP 下载化合物的化学结构。利用Autodock Tools 对受体和配体进行处理后，使用Autodock Vina 进行分子对接和结合自由能的计算。对接结果见表2。根据相关文献资料显示，结合能＜-5.0 kJ/mol 即可认为有较强的亲和力[19]。对接结果显示，木通活性成分与作用靶点之间有较好的结合能力，一定程度上验证了网络药理学结果准确性。

表2 靶点蛋白与对应小分子对接得分

各活性成分与靶标相互作用情况见图5（封三、四）。

2.6 GO 生物功能和KEGG 通路分析

利用Metascape 平台，将“2.4”项条件下筛选得到的核心靶蛋白基因上传，并进行GO 和KEGG 通路的富集分析，根据P＜0.01，选取前20 个GO 生物过程条目，主要包括端粒组织（telomere organization）、细胞凋亡信号通路（apoptotic signaling pathway）、生物节律（rhythmic process）、对生长因子应答（response to growth factor）、调节细胞压力应答（regulation of cellular response to stress）等，具体见表5。

同样得到KEGG 信号通路，根据P 值筛选取前20 条，主要涉及到病毒致癌作用（Viral carcinogenesis）、EB 病毒感染（Epstein-Barr virus infection）、癌症中的转录失调（transcriptional misregulation in cancer）、MAPK 通路（MAPK signaling pathway）、甲状腺信号通路（thyroid hormone signaling pathway）、致病性大肠杆菌感染（pathogenic Escherichia coli infection）、军团杆菌病（legionellosis）等。再利用Metascape 平台对数据进行可视化处理并聚类，具体见图6。

从20 个聚类中的每个聚类选择具有最佳P 值的项，并限制每个聚类不超过15 个项。其中相似性大于0.3 项将会被用线段连接。其中每个节点代表1 个被富集的通路，并根据它的KEGG ID 进行着色（图6a，见封四），再由其P 值进行着色（图6b，见封四）。

3 讨论

现代医学证据表明，木通属木通在抗血栓[20]、抗肿瘤[21-23]、抗炎抑菌[24]等方面均有突出表现。涉及到的可能机制包括氧自由基代谢[22]、抑制络氨酸激酶[21]、提高机体抗氧化应激、激活细胞凋亡的线粒体途径和死亡受体途径[23]等。与GO 和KEGG 通路中部分分析结果相同。

PPI 网络显示，木通中的活性成分可能是通过调节CASP9、PGR、HSP90AB1、CHRM1、CHRM2、ADRB2、PRKACA 等来调控泌尿系统疾病的。分子对接结果也一定程度上证明了选择的准确性。CHRM2 又称为毒覃碱型乙酰胆碱受体M2，属于G 蛋白偶连受体家族。毒蕈碱型乙酰胆碱受体介导各种细胞应答，包括抑制腺苷酸环化酶、磷酸肌醇分解和通过G 蛋白的作用调节钾通道。CHRM2 和CHRM3 不仅可以介导人类逼尿肌平滑肌细胞的收缩，还可以通过Akt/PI3K和蛋白激酶介导平滑肌细胞增殖[25]。PRKACA 又称c-AMP 依赖的蛋白激酶α，它参与脂质和葡萄糖的代谢，并是GPCR 信号转导机制的重要组成部分。与PRKACA 相关的疾病包括肾上腺皮质疾病、前列腺癌等[26]。除此之外，网络拓扑分析还显示，该过程与多种免疫球蛋白、转录因子、Ras 途径相关蛋白有关，例如整联蛋白亚基α4（ITGA4）、血管细胞间黏附分子1（VCAM1）、生长因子受体结合蛋白（2GRB2）等。而泌尿系统疾病多与细菌病毒感染以及肿瘤生成有关，机体可以通过免疫反应对细菌病毒以及肿瘤细胞进行杀伤清除，Ras 信号途径也与细胞生长增殖有关，常会导致发生肿瘤。此过程充分证明了，木通治疗泌尿系统疾病是通过多成分、多靶点、多途径进行调控的。

表5 木通调控泌尿系统疾病的核心网络GO 生物过程分析

分数指核心靶蛋白基因注释到特定GO Term 的基因数目，百分率为核心靶蛋白基因注释特定通路的基因的比例，“Log10（P）”是以10 为底的对数表示的P 值，“Log10（q）”是Log 以10 为底的多检验调整的P 值，能更好控制假阳性率。P 值代表显著性，Log10（P）和Log10（q）值越小则证明结果越可靠

GO 生物过程分析主要涉及到细胞凋亡、细胞分裂、细胞对氮化合物的应激、细胞对氧化应激的反应和调节细胞应激反应等过程。Wang 等[27]证明木通果皮提取物（APE）能够改善上皮屏障破坏，抑制免疫细胞的增殖和浸润，调节一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）的分泌，降低一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2）的表达以及在体内调节氧化应激。KEGG 通路分析结果显示，木通调节泌尿系统主要涉及到了MAPK 通路，线粒体自噬，p53 信号通路，细菌感染等。MAPK 通路主要介导细胞凋亡，分化和增殖等。Koo 等[28]证明了木通提取物具有抗炎特性，并通过抑制p38 MAPK/NF-κB 信号通路来调节TNF-α 诱导的黏附分子表达。线粒体自噬有助于维持一个健康的线粒体网络和防止细胞程序性死亡，Gong 等[29]也证明了木通提取物能够参与线粒体自噬。Zhou 等[30]提出了木通皂苷可能通过p53 信号通路上调p53 的表达，抑制肿瘤细胞增殖，从而达到治疗肿瘤的目的。Okumura 等[31]也证明化合物AKB-4924（木通提取物）可以提高HIF-1 水平，并增强吞噬细胞对金黄色葡萄球菌对甲氧西林敏感和耐甲氧西林的菌株的抗菌活性。许多研究也证明了木通的杀菌消炎能力[27-28，32-33]。这些研究与本研究预测结果一致，也再次证明了木通治疗泌尿系统疾病是通过多靶点、多途径共同起作用的。

本文基于网络药理学，对木通治疗泌尿系统疾病的活性成分和作用机制进行了分析，并用分子对接技术进行了验证，得到木通活性成分与重要靶点之间存在较好的结合活性。一定程度上验证了网络药理学的准确性。网络药理学的结果为进一步实验探究其作用机制提供了基础。值得注意的是，近年来屡有马兜铃科关木通制成的中成药引起肾毒性问题的报道，引起对木通用药的误解。而《神农本草经》等著作中所记载的木通为木通科木通，非马兜铃科关木通，历朝历代也无关木通入药的记载[34]。实验研究表明，关木通能显示明显的肾脏毒性，而木通属木通未见明显的药物相关毒性反应[9]。因此提示研究者用药时需注意不同种属木通的选择，尽可能规避肾毒性。

[参考文献]

[1]曾友长.台湾中医药治疗泌尿系统疾病及研究[C].//闽台中医药文化研究论文集上册（1988～1994）.2007.

[2]王慎鸿，高云球，谭洪鳌，等.中西医结合治疗下尿路感染临床治疗方案的规范化研究及疗效分析[J].浙江中医药大学学报，2013，37（10）：1197-1200.

[3]李雪梅.基于古今文献研究利水渗湿药功效的认识发展[D].南京：南京中医药大学，2020.

[4]肖蕾，项忠景，陈宝国.中医药治疗慢性泌尿系感染研究进展[J].河北中医，2016，38（11）：1748-1751.

[5]刘世巍.扶正清热利湿法防治再发性尿路感染的临床与实验研究及病原学分析[D].北京：中国中医科学院，2012.

[6]阚红卫，杨士友.中药治疗尿路感染的研究进展[J].中国医药导报，2008，5（30）：18-19.

[7]柳岳超，李洪亮，曾小华，等.三叶木通藤茎的化学成分和药理作用研究进展[J].上海中医药大学学报，2020，34（3）：99-106.

[8]陈依键.《临证指南医案》咳嗽篇方药配伍特点研究[D].哈尔滨：黑龙江中医药大学，2020.

[9]刘桂艳，王晔，马双成，等.木通属植物木通化学成分及药理活性研究概况[J].中国药学杂志,2004，39（5）：330-332，352.

[10]李泮霖，苏薇薇.网络药理学在中药研究中的最新应用进展[J].中草药，2016，47（16）：2938-2942.

[11]段贤春，黄石，彭代银，等.网络药理学在中药复方研究中的应用[J].中国药理学通报，2020，36（3）：303-308.

[12]解静，高杉，李琳，等.网络药理学在中药领域中的研究进展与应用策略[J].中草药，2019，50（10）：2257-2265.

[13]Ru J，Li P，Wang J，et al.TCMSP：a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J].J Cheminform，2014，6（1）：13.

[14]Chen H，Boutros PC.Venn Diagram：a package for the generation of highly-customizable Venn and Euler diagrams in R[J].BMC Bioinformatics，2011，12：35.

[15]Shannon P，Markiel A，Ozier O，et al.Cytoscape：a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks[J].Genome Res，2003，13（11）：2498-2504.

[16]Trott O，Olson AJ.Auto DockVina：improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function，efficient optimization，and multithreading[J].J Comput Chem，2010，31（2）：455-461.

[17]Tang Y，Li M，Wang J，et al.CytoNCA：a cytoscape plugin for centrality analysis and evaluation of protein interaction networks[J].Biosystems，2015，127：67-72.

[18]Wang S，Wang H，Lu Y.Tianfoshen oral liquid：a CFDA approved clinical traditional Chinese medicine，normalizes major cellular pathways disordered during colorectal carcinogenesis[J].Oncotarget，2017，8（9）：14 549-14 569.

[19]刘枭，许云，徐银莹，等.白花蛇舌草治疗子宫肌瘤机制的网络药理学研究[J].中药新药与临床药理，2020，31（9）：1070-1078.

[20]耿涛，孟兆珂，耿令奎，等.木通提取物对实验性大鼠静脉血栓形成的影响[J].中国现代应用药学，2009，26（6）：462-464.

[21]孙悦文.广西特色中草药靶向抗肿瘤筛选及裂果薯皂苷的分离与抗肿瘤作用研究[D].南宁：广西医科大学，2013.

[22]白雪，关宝生，魏晓东，等.八月札水提物对H_（22）荷瘤鼠血清总抗氧化能力、超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的影响[J].社区医学杂志，2010，8（11）：4-5.

[23]白雪.常春藤皂甙元抗肝癌作用研究[D].咸阳：西北农林科技大学，2017.

[24]白梅荣，张冰，刘小青，等.三叶五叶木通提取物药效及对药酶影响的比较研究[J].中华中医药学刊，2008，26（4）：732-735.

[25]Arrighi N，Bodei S，Zani D，et al.Different muscarinic receptor subtypes modulate proliferation of primary human detrusor smooth muscle cells via Akt/PI3K and map kinases[J].Pharmacol Res，2013，74：1-6.

[26]Turnham RE，Scott JD.Protein kinase A catalytic subunit isoform PRKACA；History，function and physiology[J].Gene，2016，577（2）：101-108.

[27]Wang X，Yu N，Peng H，et al.The profiling of bioactives in Akebia trifoliata pericarp and metabolites，bioavailability and in vivo anti-inflammatory activities in DSS-induced colitis mice[J].Food Funct，2019，10（7）：3977-3991.

[28]Koo HJ，Sung YY，Kim HK.Inhibitory effects of Akebia quinata ethanol extract on TNF-α-mediated vascular inflammation in human aortic smooth muscle cells[J].Mol Med Rep，2013，7（2）：379-383.

[29]Gong LL，Yang S，Zhang W，et al.Akebia saponin D alleviates hepatic steatosis through BNip3 induced mitophagy[J].J Pharmacol Sci，2018，136（4）：189-195.

[30]Zhou P，Ma L，Zhou J.Study on the mechanism of akebia saponin D for leukemia[J].Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2012，32（1）：84-88.

[31]OkumuraCY，HollandsA，TranDN，etal.Anewpharmacological agent（AKB-4924）stabilizes hypoxia inducible factor-1（HIF-1）and increases skin innate defenses against bacterial infection[J].J Mol Med（Berl），2012，90（9）：1079-1089.

[32]Gong LL，Yang S，Liu H，et al.Anti-nociceptive and antiinflammatory potentials of Akebia saponin D[J].Eur J Pharmacol，2018，845：85-90.

[33]Choi J，Jung HJ，Lee KT，et al.Antinociceptive and antiinflammatory effects of the saponin and sapogenins obtained from the stem of Akebia quinata[J].J Med Food，2005，8（1）：78-85.

[34]米杰.慢性马兜铃酸肾病的中西医结合治疗[J].山东中医药大学学报，2005，29（4）：281-282.