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主要组织相容性复合体（MHC）是一种表达于脊椎动物细胞表面分子，介导机体内免疫细胞与其他细胞之间的相互作用，在机体识别“自己”和清除“异己”过程中发挥着至关重要的作用[1]。MHC 分子，主要分为两大类，分别是MHC Ⅰ类分子和MHC Ⅱ类分子。MHC Ⅰ类分子表达于所有有核细胞表面，负责内源性抗原的递呈[2]。MHC II 类分子表达在专职的抗原递呈细胞（APC）表面，负责外源性抗原的递呈[3]。MHC分子在人类又称为白细胞抗原（HLA），Ⅰ类基因主要为经典的HLA-A、HLA-B 和HLA-C 基因，表达在大多数有核细胞的表面[4-5]；II 类基因主要为DR、DP 和DQ[6]。新合成的MHC Ⅰ类分子在粗面内质网中，重链的第86 位天冬酰胺处发生糖基化，再经葡萄糖酶催化形成单糖苷聚糖[7]，随后与轻链β2m 形成二硫键，形成稳定的异源二聚体结构，结合抗原多肽，通过滤泡转运到细胞表面，由CD8＋细胞毒T 淋巴细胞识别，从而活化T 细胞[8]。

蛋白质是生物学功能行使的直接参与者，机体内的生命活动广泛涉及到蛋白质的修饰，包括糖基化、甲基化、乙酰化、泛素化和磷酸化等[9]。蛋白质的修饰对其功能的发挥具有重要的决定作用[10]。本研究将HLA-C 的第86 位的天冬酰胺突变成丙氨酸，使其无法发生糖基化。经蛋白免疫印迹（Western Blot）验证，突变后，由于其无法发生糖基化，其蛋白分子量在30 KD左右，比正常的HLA-C 分子分子量小2～3 kD，符合预期[11]。同时进行免疫荧光，观察其在细胞中分布，为HLA-C 糖基化修饰功能研究奠定一定的基础。

1 材料与试剂

1.1 细胞、菌株和载体

人胚肾细胞（293T）购自ATCC，带Flag 标签和荧光标签的PCMV 载体质粒购自addgene，DH5α 感受态细胞购自康为世纪生物科技有限公司。

1.2 主要试剂

BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、Xba Ⅰ、Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ等限制性内切酶和预染蛋白质分子质量标准以及Lipo2000 购自赛默飞世尔科技公司；质粒小提试剂盒、DNA 片段回收试剂盒均购自康为世纪公司；SDSPAGE 预制胶购自金斯瑞公司；Trizol 总RNA 提取试剂购自Takara 公司；BCA 蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，抗Flag 小标签抗体以及HRP标记的抗鼠二抗均购自CST 公司。

2 方法

2.1 引物设计及合成

参照NCBI GenBank 中公布的HLA-C 的编码序列，设计其上下游引物。根据文献报道[1]，设计突变引物HLA-C-M，将第253～255 位编码天冬氨酸的碱基GAC 突变为编码丙氨酸的GCC。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

HLA-C-F：5′-GGAATTCATGCGGGTCATGGCGCCC-3′；HLA-C-R：5′-CGGGATCCCGGGCTTTACAAGT GATGAGAGACTCATCAGA-3′。

HLA-C-M-F：5′-GGAGTATTGGGCCCGGGAGACACAGAAGTA-3′；HLA-C-M-R：5′-TACTTCTGTGTC TCCCGGGCCCAATACTCC-3′。

2.2 核酸提取及目的基因扩增

收集健康人外周血单核细胞，提取细胞中总的RNA进行逆转录，获得cDNA。以cDNA 为模板，HLAC-F/R 为引物，PCR 扩增HLA-C 基因。PCR 扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35 循环；72℃延伸10 min。聚合酶链式反应（PCR）产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收，获得HLA-C 基因。HLA-C 突变体基因扩增，具体步骤如下。第一步以HLA-C-F 和HLA-C-M-R 为引物，HLA-C 基因为模板进行扩增，PCR 产物进行回收；第二步以HLA-C-M-F 和HLA-C-R 为引物，HLA-C 基因为模板进行扩增，PCR 产物进行回收；第三步以HLA-C-F/R 为引物，第一步和第二步回收产物共同作为模板进行扩增，PCR 产物进行回收，获得HLA-C-M 基因。

2.3 真核表达载体构建

将HLA-C 基因和HLA-C 突变基因，酶切后回收，分别与带有Flag 标签的PCMV 载体连接，转化DH5α 感受态细胞，在LB 固体培养基上37℃过夜培养，挑取单菌落，液体LB 培养基中震荡培养8 h，对菌液进行质粒小提，质粒双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定正确的菌液取部分送苏州金维智生物科技有限公司进行测序。

2.4 质粒转染及表达

293T 细胞扩大培养到一定数量后，消化接种于12 孔细胞培养板，按照Lipo2000 进行转染。将转染后的细胞放入37℃、含5%二氧化碳的细胞培养箱中培养14～18 h。

2.5 Western Blot 检测

收集分别转染了HLA-C-Flag 和HLA-C-MFlag 的细胞，进行蛋白提取，使用BCA 试剂盒对蛋白进行定量，经SDS-PAGE 后，转印到PVDF 膜上，5%的脱脂奶粉封闭1 h 后，抗Flag 小标签抗体作为一抗，4℃过夜孵育，以HRP 标记的山羊抗鼠作为二抗，室温孵育2 h，应用增强型ECL 化学发光，检测HLAC-Flag 蛋白和HLA-C-M-Flag 蛋白的表达。

2.6 HLA-C-cherry 和HLA-C-M-cherry 质粒构建及表达

HLA-C-Flag 质粒和HLA-C-M-Flag 质粒进行酶切回收，将回收的HLA-C 和HLA-C-M 片段，与cherry 红色荧光的载体连接，转化DH5α 感受态细胞，在LB 固体培养基上37℃过夜培养，挑取单菌落，液体LB 培养基中震荡培养8 h，质粒小提试剂盒提取质粒。

2.7 免疫荧光-激光共聚焦检测

293T 细胞接种在铺有细胞爬片的24 孔细胞培养板中，分别转染HLA-C-cherry 和HLA-C-M-cherry质粒，培养18 h 后取出细胞培养板，PBS 洗涤后，加入4%多聚甲醛4℃固定1 h 后，PBS 洗涤，加入1%Triton 通透10 min，PBS 洗涤后进行封闭，加入DAPI进行染核，封片后激光共聚焦显微镜观察。

3 结果

3.1 HLA-C-Flag 和HLA-C-M-Flag 真核表达载体构建

将HLA-C 和HLA-C-M 基因插入到PCMV 载体，双酶切进行鉴定，基因大小没有差异（图1）。

图1 HLA-C 和HLA-C-M 真核表达载体双酶切电泳

M：Marker；1：HLA-C 载体酶切；2：HLA-C-M 载体酶切

3.2 HLA-C-Flag 和HLA-C-M-Flag 蛋白表达

将HLA-C-Flag 和HLA-C-M-Flag 质粒分别转染进293T 细胞，进行Western Blot 检测。结果显示，HLA-C 糖基化位点突变后，蛋白分子量比正常HLAC 蛋白要小（图2）。

图2 Western Blot 检测HLA-C 和HLA-C-M 蛋白表达

M：Marker；1：HLA-C 蛋白；2：HLA-C 糖基化位点突变蛋白

3.3 HLA-C-cherry 和HLA-C-M-cherry 荧光质粒表达

HLA-C 主要功能是抗原递呈，可以将细胞内的抗原肽转运到细胞膜表面。因此本研究分别构建了带荧光标签的HLA-C-cherry 和HLA-C-M-cherry 质粒，通过免疫荧光观察正常HLA-C 蛋白和糖基化位点突变的HLA-C 蛋白在细胞中的表达情况。结果显示，未突变的和糖基化位点突变的HLA-C 蛋白在胞质中均有表达。但HLA-C 糖基化位点突变后，在膜周围聚集的现象减少（图3，封三）。

4 讨论

主要组织相容性复合体主要参与T 细胞介导的细胞免疫，T 细胞通过T 细胞受体识别MHC 分子递呈的抗原肽，活化T 细胞来杀伤靶细胞，因此MCH 在肿瘤免疫和病毒免疫中发挥着重要的功能[12]。有文献报道，肿瘤细胞可以下调细胞表面的MHC Ⅰ类分子的表达，从而躲避机体抗肿瘤免疫[13]。另外，牛I 型单纯疱疹病毒蛋白UL41，可以降解MHC Ⅰ类分子的mRNA，从而降低细胞表面MHC Ⅰ类分子表达，来逃逸机体抗病毒免疫[14]。糖基化对蛋白质的稳定性具有一定的作用。有文献报道，β 干扰素和白介素-15 经过糖基化修饰后，与未经糖基化修饰的相比，其对热变形的抵抗力明显增强[15]。同样糖基化修饰的牛胰蛋白酶稳定性也比无糖基化修饰强，原因是糖链会一定程度的遮盖掉蛋白表面的酶位点，从而增强蛋白质对酶的抵抗力[16]。

新合成的MHC 分子重链分子发生糖基化后，与钙联蛋白结合，随后钙联蛋白招募内质网伴侣蛋白ERp57 促进重链二硫键的形成，此时轻链β2m 也参与，与重链形成异源二聚体，组成完整的MHC 分子结构[17]。细胞内的抗原被各种蛋白酶水解后，产生的抗原多肽被TAP 转运至内质网，装配到MHC 分子上，形成MHC-抗原肽复合体，该复合体与内质网中其它协助蛋白结合，将结合的抗原肽转运到细胞表面[18]。

本研究通过PCR 方法成功扩增了HLA-C 基因，同时将HLA-C 的第86 位的天冬酰胺突变成丙氨酸，使其无法发生糖基化修饰。扩增所得片段大小符合预期，并构建了带有Flag 小标签的真核表达质粒，转染进细胞后进行Western Blot 检测，结果显示，天冬酰胺突变成丙氨酸后，蛋白大小变为30 kD 左右，比正常的HLA-C 蛋白小约3 kD，这是由于本研究将第86位的天冬酰胺突变成丙氨酸，造成突变体无法发生糖基化修饰，导致蛋白分子量变小。另外本研究还成功构建了带有红色荧光cheery 标签的质粒，转染进细胞后，通过激光共聚焦显微镜观察，发现突变体更多的表达在细胞质中。正常情况下，MHC 重链上的单糖苷聚糖链会与钙联蛋白结合，招募协助蛋白和MHC-β2m 形成了一个稳定的多结合位点复合体，可以促进MHC Ⅰ类分子的正确折叠。将天冬酰胺突变成丙氨酸后，重链分子无法进行糖基化修饰形成单糖苷聚糖链，可能会影响钙联蛋白与重链上糖链的结合。本研究为MHC Ⅰ类分子糖基化修饰研究奠定良好的基础。

图3 激光共聚焦显微镜观察HLA-C 和HLA-C-M 在细胞中的表达（1000×）（见内文第32页）

A：激光共聚焦观察HLA-C-Cherry 在细胞中的表达；B：DAPI 染核，HLA-C-Cherry 在细胞中的表达；C：HLA-C-M-Cherry 在细胞中的表达；D：DAPI 染核，HLA-C-M-Cherry 在细胞中的表达

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