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急性呼吸道感染是由多种因素（生物、物理、化学等刺激）引起的呼吸道急性炎症的总称，具有发病率高、传播快速、容易大流行等特点，常见于肺炎支原体与呼吸道病毒，后者是成年人住院的常见原因。不同地区的感染率、病毒感染种类均不相同[1]。在临床诊断治疗呼吸道病毒感染引发的疾病中，临床标本微生物检验是极为重要的科学性依据之一。影响微生物检验阳性率的因素较多，通常包括标本的采集、细菌培养、分离检测和结果鉴定四个环节的因素。标本的采集和运送作为病毒检测的第一步，其正确性是保证检验结果准确的最基本条件[2]。病毒诊断的成功很大程度上取决于标本的质量以及在实验室处理标本之前运输和存储标本的条件。基于此，本文主要对呼吸道病毒检测的部分环节进行分析探讨，有助于检验前的标本质量控制和检验结果的准确性。

检测呼吸道病毒的适当标本前，首先需要了解呼吸道病毒的传播途径，其主要有吸入感喷嚏产生烟雾和通过呼吸道粘膜自身接种的毒气都可能传播病毒。动物和气候模型系统表明，在特定的环境条件下，例如低温和低湿度，呼吸道病毒的传播可能会增强。对于实验室人员和临床医生而言，根据呼吸道病毒的可能传播途径和传播特点，可实施适当的感染控制措施、选择适当的标本类型并安全地进行实验室操作[3]。

1 基于检测方法和病毒类型选择合理的标本类型

急性呼吸道感染病毒病原诊断通常采用呼吸道标本，包括拭子，刷子，抽吸物和洗液，并且标本可以从许多部位采集，包括前后鼻咽，口咽和鼻孔。上呼吸道标本主要包括口咽拭子、鼻咽拭子、鼻咽吸取物；下呼吸道标本包括痰液、气管吸取物、支气管肺泡灌洗液等。上呼吸道标本检出的病毒能否真正反映下呼吸道感染病原，目前尚有争论，但是存在一些呼吸道标本难以获得的情况，因此常用鼻咽吸取物和鼻咽拭子代替下呼吸道标本[4]。

研究发现样本不同类型对不同病毒的检测性能有差异。有研究对比了鼻咽拭子和口咽拭子，鼻咽拭子对B 型流感病毒，副流感病毒2 和副流感病毒3 检测敏感度更佳，口咽拭子对甲型流感病毒，2009 甲型H1N1 病毒、腺病毒检测敏感度更佳。其中原因之一是由于病毒感染呼吸道的位置，举例来说，所有流感病毒均会感染从鼻咽到细支气管的呼吸道上皮细胞，但是2009 甲型H1N1 病毒可以感染呼吸道的下部，包括肺泡。与鼻咽拭子相比，口咽拭子更深入呼吸道。因此口咽拭子对2009 甲型H1N1 病毒的敏感性更高[5]。综上所述，检测呼吸道病毒时，要根据待检测病毒的感染特点来选择合适的样本类型。

1.1 鼻咽拭子和鼻咽吸取物

1.1.1 鼻咽拭子有研究[6]表明，在使用多重实时逆转录（RT-PCR）检测呼吸道标本时，鼻咽拭子是最佳的检测标本类型。通常认为，检测呼吸道病毒的最佳标本类型是鼻咽抽吸物标本。鉴于用于获取鼻咽抽吸物标本的方法的复杂性和侵入性，鼻咽拭子已成为一种替代标本类型。并且，在该研究[6]中，鼻咽拭子在RTPCR 中显示出优于或等同于鼻咽吸取物标本。因而鼻咽拭子被广泛用作呼吸道病毒检测的RT-PCR 的标本，是医院常用呼吸道标本类型。

鼻咽拭子标本与敏感的分子检测相结合，是一种侵入性较小的诊断性呼吸道标本，具有足够的敏感性，可适用于临床和医院门诊。例如对于儿童的主要呼吸道病毒（甲型流感和呼吸道合胞病毒），Lambert等[7]收集了303 对鼻咽吸取物/鼻咽拭子配套标本，发现对于大多数病毒，NPA 的敏感性等于或高于NTS标本。例如对于腺病毒，鼻咽拭子标本的敏感性（65.9%）低于鼻咽吸取物（93.2%），差异有统计学意义（P＜0.05）。考虑到这一点，对于到医院就诊住院的儿童来说，诊断是否感染禽流感或大流行性流感病毒时，鼻咽吸取物或类似的收集技术（例如洗鼻液）仍为首选。

Li 等[8]通过检测咽炎患者中的15 种常见病毒（包括流感病毒、副流感病毒、腺病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、肠道病毒、人冠状病毒和人间质肺病毒）发现，鼻咽拭子的检测敏感度方面（74%）均优于鼻洗液（49%）和口咽拭子（49%）。其中鼻咽拭子对鼻病毒和腺病毒的检测敏感度高于鼻洗液和口咽拭子，且具有统计学意义。另一方面，目前尚不清楚鼻咽拭子标本是否能被检测到多重RT-PCR 靶向的所有病毒，并且其采集需要有经验的人员。在操作上，正确收集鼻咽拭子需要插入的深度等于从鼻孔到耳朵外部开口的距离。正确执行这种采样技术时，通常会造成某些患者不适。但是，如果拭子插入深度不够，会造成病毒采样不足从而使得检测灵敏度下降。获取鼻咽拭子标本时，取样会使大多数患者咳嗽，这也可能会增加医院内传播病毒的风险[9]。

1.1.2 鼻咽拭子与口咽拭子组合针对流感病毒为例，有文献综述基于检测方法RT-PCR，比较了单个标本采集方法与通过同一项研究中的任何方法进行检测的敏感性，得出分析结论为将两种侵入性较小的拭子方法（例如鼻拭子和口咽拭子）组合使用，可能与鼻咽拭子通过RT-PCR 检测流感病毒的检测敏感性大致相同。同时，数据分析得出在儿童和成年人里，两种收集方法的组合检测到的感染数量比单一样本类型所检测到的数量均有所增加。检测成年人样本中呼吸道病毒时，收集两种不同的呼吸道标本对检测结果可能会更加有利，在观察儿童检测的研究里表现出，各种收集方法的敏感性差异较小，多种收集方法的组合对结果的检测性能提高而言收益不大。关于新型冠状病毒（COVID-19）的检测中也提到了同时采集1 份鼻咽拭子和1 份口咽拭子于同一标本采集管中可以提高阳性率[10]。同时，发现大多数参与者认为与鼻吸、洗鼻液和鼻拭子取样比较，鼻刷取样引起的不适感最大。因此，通过结合两种侵入性较小的收集方法很可能在不影响流感病毒检测灵敏度的情况下减少患者采样的不适并可因此更容易重复采样而提高患病个体的流感病毒检测效率[11]。临床检测和科研实验中可以考虑两种侵入性较小的收集方法。

1.2 口咽拭子

口咽拭子标本比鼻咽拭子标本较容易获得，但比唾液标本较难获得。另外，此前一些研究表明，通过RT-PCR 检测呼吸道病毒时，口咽拭子和鼻咽拭子中，综合而言，鼻咽拭子是更好的选择[6]。

1.3 痰标本

先前研究中，通过多重RT-PCR 比较鼻咽拭子和痰标本用于呼吸道病毒的检测的效果时发现，对于大多数类型的病毒，痰标本的检出率明显更高。在检测到A 型流感病毒INF 和A 型呼吸道合胞病毒RSV时，痰标本相对于鼻咽拭子的优势更为明显，这与为下呼吸道感染有关。但是，此前研究指出，使用痰液样本也有一定的局限性。首先，由于其具有高粘度的性质，痰需要额外的核酸提取预处理程序，这一程序尚未标准化，因此如果预处理标本不当，可能会导致无效的RT-PCR 结果。其次，一些患者，例如年幼的儿童和老年患者，不能产生痰[6]。

Hun 等[12]发现，在25%的呼吸道病毒阳性痰的成年患者中，其对应鼻咽拭子标本的检测结果为阴性，使用实时多重RT-PCR 技术，成人痰液样本的总体检出率显著高于鼻咽拭子。在对多种标本类型进行测试的研究中，可能发现某些患者鼻咽拭子标本呈阴性呼吸道病毒感染，而痰或其他下呼吸道标本可能包含较高的病毒载量，痰标本的使用将改善病毒的检测[13]。曾江等[14]研究也阐述了因为雾化诱导痰所收集的痰标本主要来源于下呼吸道，而咽拭子采集的标本主要来自上呼吸道，如果患者的病毒数量不够多，因此蔓延到上呼吸道的病毒量较少，导致采集样本中的病毒载量少于检测限，在检测过程中可能会造成假阴性的结果，因此诱导痰检测效果优于咽拭子标本。而对于上呼吸道取材标本来说，鼻咽部位于鼻腔的后方，口咽的上方，分泌物易滞留在此处，在此处取样更容易获得阳性结果，一般而言，标本检测阳性率应是鼻咽拭子优于鼻拭子和口咽拭子。

同样的，在Falsey 等[15]的研究中，提出了相同的理论，即使用RT-PCR 方法检测时，痰标本显示的成人诊断率是高于鼻咽拭子的。同时，其研究的数据表明，鼻咽拭子和痰液检测可产生互补的结果。最具成本效益的病毒检测方法可能是组合样品检测方法，而不是用单一类型样本进行RT-PCR 分析。这位学者提出了一个设想，可以使用鼻咽拭子中的病毒运输介质稀释痰液样本，或者可将拭子浸入痰液样本中，并与鼻咽拭子一同混合在病毒运输介质中。这些方法简答易行，并提高了检测病毒载量，可能可以利用在急诊环境中。目前这一设想还需要对组合的样品测试和样品处理进行进一步的研究。

痰液适合于病毒核酸和病毒抗原检测。应当注意于清晨进行采集，先让患者刷牙并用无菌盐水漱口3次，再用力向无菌收集器咳嗽咳出深部痰液。应注意气管内吸痰时20 个油镜视野下未发现细菌与低倍镜视野下大于10 个鳞状细胞或者痰液标本观察时低倍镜视野下大于10 个鳞状细胞为不合格标本[16]。

1.4 唾液标本

较鼻咽拭子和鼻咽吸取物，唾液标本采集较为便利，减少了与标本采集相关的时间和成本，同时，唾液标本取样痛苦较小，可以减轻患者的不适。该研究中，鼻咽拭子和唾液样本的总检出率是86.4%（204/236），高于鼻咽拭子标本的77.5%（183/236）和唾液标本76.3%（180/236），唾液样品的总检出率与鼻咽拭子标本相当。可以看出唾液是检测呼吸道病毒的可行选择，十分具有潜力。在现实生活中，可以添加唾液样本来提高患者呼吸道病毒检出率。因为同时测试多个标本类型增加了实验成本，相关文献[6]提出了更具成本效益的方法，即用额外较小工作量和低成本获得唾液样本，将鼻咽拭子与唾液标本混合之后，在进行呼吸道病毒检测，可以有效地提高检出率。

1.5 气溶胶

研究展示了一种新的呼吸道病毒标本——患者产生的气雾剂——有可能在不久的将来成为诊断肺部感染的临床有用标本的潜力。鼻咽拭子和口咽拭子，吸出物和洗液会从上呼吸道提供粘液，这些粘液并不总是具有与下呼吸道相同的病毒载量或相同种类的病毒。收集、检测患者在咳嗽和潮气呼吸期间产生的气溶胶颗粒可作为收集呼吸道病毒的诊断标本的一种非侵入性的方法。研究使用流感患者作为样本，在患者气溶胶标本中检测到了流感病毒RNA，同时发现鼻咽拭子中的流感病毒拷贝数与气溶胶颗粒中的病毒拷贝数之间的相关性最弱，表明病毒气溶胶源自肺部感染而不是头部气道感染。因此，与鼻咽拭子相比，呼吸道气雾剂可能为下呼吸道感染提供更具代表性的诊断标本来源。由于这是一种非侵入性的方法，更容易重复检测，因而可适用于监测病程。

目前此种标本采集和检测还存在待解决的问题，例如设计适用于生物气溶胶的收集方法，因为收集时易夹带室内空气而使气溶胶稀释、气溶胶本身所含的病毒物质量少并且随后难以检测病毒等[17]。

1.6 中鼻甲植绒标本

近年Howard[3]的研究中通过直接荧光抗体技术检测了153 例呼吸系统症状患儿的配对鼻咽吸取物和中鼻甲植绒标本，发现在儿童中，中鼻甲植绒标本检测常见呼吸道病毒（如呼吸道合胞病毒和人类偏肺病毒）方面与鼻咽吸取物相当。不同于鼻咽拭子，它具有采样深度指示计，并且比较小的鼻咽拭子具有更大的吸收能力。

2 标本采集过程中采样方式与选用拭子类型影响检测结果

2.1 拭子类型

选择拭子类型对检测结果亦会对检测结果产生影响，不同材质的拭子适用于不同呼吸道病毒检测方法，例如尼龙纤维制成的植绒材料能收集到更多的呼吸道上皮细胞，适于直接免疫荧光法；聚氨酯纤维材料的拭子更适合用于采集过程中较易出血的患儿。普通木柄的棉拭子可能含有对细胞培养有害的物质，且常不能采集到足够量的脱落细胞，不适用于鼻咽或口咽部分泌物的采集[4]。研究发现即使在室温下保存15 d，也可以从常规的棉签或植绒拭子中成功提取病毒RNA。但植绒拭子比常规棉签具有更优秀的性能，这种拭子不仅可以长时间保持RNA 稳定，而且从拭子中释放出的核酸量与呈阳性曲线的时间高度一致。尽管仍可根据研究和常规诊断工作结果推荐棉签拭子，但将植绒拭子与分子检测结合使用可进一步提高呼吸道病毒的检出率。如果样品要远距离运输到实验室或样品处理有延迟，则植绒拭子的优势更大[18]。例如最近急性严重呼吸综合征冠状病毒2（SARSCoV-2）检测研究中，推荐选用合成纤维或人造纤维，不推荐海绵或棉花拭子，因为棉花的纤维对蛋白质吸附较强，导致病毒不易洗脱到保存液中，另一种尼龙类的纤维的吸水性不佳，从而导致采样量不足，影响检出效率，也不被推荐[19]。

2.2 采集方式

由于多数病毒性急性呼吸道感染，病毒的排泌发生在症状出现前，病毒量在症状出现后迅速增加，之后逐渐下降，标本应尽快采集。对于免疫功能低下的感染者，较长时间内都可能检测到病毒。尽可能采集多种类型的标本和（或）连续多个时间点采集不同部位的标本，以满足多种检测方法的联合检测，同时要注意标本采集量[4]。Liesbeth 等[20]在研究中观察到，左右鼻孔之间甲流病毒载量的差异可能与定量RTPCR 的变异性、鼻孔之间的生物学差异、取样偏倚或这些的任何组合有关。定量RT-PCR 技术的特点是内部和内部变异性低。由此进一步提出了，右撇子或左撇子可能会获得与右鼻孔或左鼻孔不同的拭子，或者拭子的服用顺序也会引起变异，目前这个问题有待进一步的研究。生物学差异可能包括解剖上的鼻子、鼻中隔异常、病毒脱落或鼻孔堵塞导致的变异性。研究中显示出的差异表明，左右鼻孔之间的甲流病毒载量的差异突显了正确采样的重要性，对建立标准化采样程序的需求有极大帮助。解决办法：①每名患者一拭子（大多数研究现在是这种情况）；②每名患者两拭子（每个鼻孔一个），两拭子（每个鼻孔一个）收集在同一小瓶中；③使用一根拭子取样两个鼻孔。进一步探索中鼻甲拭子的使用，患者鼻孔之间的变异性，并提出一种标准的标本采集方法。这将改善对流感/呼吸道病毒的充分检测，最终将有助于在临床试验中充分监测治疗效果。

关于新型冠状病毒检测的文献中阐述了轻症、高度疑似患者或有密切接触史者，核酸标本采集优选顺序为鼻咽拭子、口咽拭子、痰液[10]。最近也有研究表明通过回顾353 名同时接受两种标本检查（鼻咽拭子和口拭子）患者的病历，在COVID-19 爆发的后期，口咽拭子的假阴性率升高，鼻咽拭子可能比口咽拭子更适合[21]。患者不同程度的感染和症状状况，应被纳入标本类型选择的考虑因素中。

3 不同病毒、实验目的下选择最合适的运输和保存方法

研究发现，对于甲型流感病毒，在＜27℃的温度下存储长达72 h，而对于乙型流感病毒，则在48 h 后，CT 值稳定。在室温或更低温度下，甲型流感病毒的运输期最多可稳定3 d，乙型流感病毒的运输期最多可稳定2 d（因此无需冷链管理）[22]。有研究通过收集和检测患者的鼻咽和口咽标本，将其保存在2～8°C 的病毒运输培养基中，并使用RT-PCR 检测甲型和乙型流感，发现病毒样品可以保存至少5 d，期间进行检测工作不会影响样品的阳性比例[23]。以急性严重呼吸综合征冠状病毒2 的临床检测为例，原则上样本应立即送检。当需要存储带检测样本时，采集后，应贴上相应的标签，样本可在4℃以下保存72 h，如果预计提取检验会延迟，则将样本储存在-70℃或更低的温度，提取的核酸应储存于-70℃或者更低的温度[19]。

相似地，理想情况下，应在临床症状发作后3 d内收集用于病毒分离的标本。用于病毒分离的临床标本应放置在4～8℃的温度下，并立即运送到实验室。如果要在48～72 h 内将临床标本运送到实验室，则可以将标本保存在4～8℃的温度下。否则，应将其冷冻在-70℃或更低的温度下，直到运输到实验室。

需要长期保存时，保存在在液氮中是最佳的。流感病毒原液应在-70～-80℃下保存并在使用前融化。为了长期存储，病毒库应保持在-135℃或液氮（-150℃）中。解冻后，应将病毒原种保存在4～8℃的冰上，并在当天使用。为防止传染性丧失，必须避免反复冷冻和解冻。当需要将病毒长期保存时，可以考虑冻干方法，其可在4℃稳定地长期保存。冻干过程可能导致病毒原种的传染性丧失。因此，仅在较低的病毒滴度不会对测定产生不利影响或没有其他长期储存选择的情况下，才应使用冻干法[24]。

研究法医微生物标本时，进行了类似的样本检测，为了评估保存活病毒和病毒基因组的能力，进行了实验研究，将流感病毒添加到通用病毒运输系统的运输介质中，并在不同温度下保存3 个月以上，然后进行病毒滴定和流感血凝素基因的定量分析[25]。结果表明，尽管在室温下保存29 d 后仍无法检测到活病毒，但即使在99 d 后，仍可以在4℃下保存。定量PCR分析表明血凝素基因在4℃和室温下均维持99 d。因此，当无法在采样后将病毒标本冷冻保存时，在通用病毒运输系统的运输介质中以4℃的温度保存是有效的。实验结果表明，在4℃下长期保存对活病毒和病毒基因组几乎没有影响。

不同种类的病毒对储存的温度和时间可能具有差别，综合分析，一般临床检测可以根据实际设备和要求情况，尽量选择储存和运输样本最优的方法。

在临床实验室检测呼吸道病毒样本时，不同标本类型及检测方法具有贮存与运输的标准。根据2018年美国传染病学会和美国微生物学会最新发布的《微生物学实验室用于传染病诊断的指南》[26] 中说明，使用组织、胸水、肺泡灌洗液等进行病毒培养时，应使用病毒转运培养基并冷藏保存，立刻送检；使用鼻咽拭子、口咽拭子、血液等体液标本进行病毒直接抗原检测时，应使用密闭容器并在2 h 内送检。

4 结论与展望

最近，使用现代分子诊断测试的大量研究表明，在40%～50%的患有急性呼吸道疾病的住院成年人中可检测到呼吸道病毒。及时检测出病毒感染，对临床诊断治疗非常重要，具有重要的临床意义。使用不同的研究人群、多种采样技术、不同的诊断检测方法（例如免疫荧光，培养和核酸扩增测试）、选择不同种类的呼吸道病毒进行测试等对选择样本类型、存储方式时间等等都具有影响。准确地检测呼吸道病毒，选择适当的标本、严谨地采集标本以及恰当运输、保存标本是得到准确、有效、及时的检测结果的基础，从而为临床工作的顺利进行提供辅助。

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