复发性流产（recurrent miscarriage，RM）指妊娠28周前发生3次及3次以上的自然流产，其发病率为1%～3%[1-2]。但多数学者认为连续发生2次流产就应给予重视并进行评估，因为其风险与流产3次者接近[3]。RM 病因复杂，各因素之间相互影响，染色体异常、内分泌失调、自身免疫因素等均可导致发病[4]。因此针对RM的诊断只能依靠各种辅助检查筛查病因。研究发现，流产胚胎细胞处于分裂中期时，纺锤体检查点（spindle checkpoint，SAC）需要确保全部染色体均能连接到纺锤体微管上，进而排列在细胞赤道板上，使细胞能够进入分裂后期[5]。BUB3（budding uninhibited by benzimida-zole 3，BUB3）是一种磷酸氨基酸衔接子，是SAC 结构相关的复合物成分之一，这些复合物具有功能不同的旁系同源物，如Bub1 相关蛋白（Bub1 related protein，BubR1）。而BubR1的水平与SAC的功能存在一定的剂量依赖，该基因一旦缺失将引起大量非整倍体产生，从而引发SAC的功能失调，细胞分裂抑制，导致胚胎发育迟缓[6-8]。本研究探讨BUB3 及BubR1 在RM患者绒毛及蜕膜组织中的表达及其与RM的关系，现报道如下。

选取2016年3月～2018年3月于广州市花都区人民医院就诊的50例稽留流产孕妇作为病例组，另选取同期50例正常人工流产妇女作为对照组。纳入标准：①符合《复发性流产诊治的专家共识》中RM 定义[1]；②自行经阴道排出妊娠组织或经临床确诊为稽留流产的患者；③RM次数（包括此次入院前妊娠后流产）≥3次。排除标准：①存在生殖道畸形者；②生殖道感染者；③患有严重肝肾等系统性疾病者。收集受试者的年龄、体重指数（body mass index，BMI）、孕次、产次、总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）等一般资料。所有研究对象或其直系亲属签署知情同意书，本研究所用方法符合《赫尔辛基宣言》，且经广州市花都区人民医院伦理委员会审核批准。

-80℃超低温冰箱（美国Thermo 公司），一抗为兔抗人BUB3、BubR1（Abcam 公司），二抗为羊抗兔IgG（Abcam 公司），BCA 试剂盒（北京中杉金桥公司），荧光实时定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪（美国Applied biosygtems 公司），Trizol 试剂（美国Invirotrogen 公司），逆转录试剂盒（北京天根生物科技公司），SYBR Premix Ex TaqTM 试剂盒（大连TaKaRa 公司），引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。TC、TG、LDL-C、HDL-C 试剂盒（批号KH216、KJ919、ER363、KF707） 均由富士胶片和光纯药株式会社提供。

1.3.1 样本采集及处理 无菌条件下对稽留流产患者进行清宫术，术后挑取胚胎绒毛组织（villous tissue，VT）、蜕膜组织（decidual tissue，DT）分成两份，一份提取总RNA，一份进行组织蛋白的提取。

1.3.2 实时荧光定量PCR 检测受试者胚胎VT、DT 中BUB3 mNRA、BubR1 mNRA 水平 采用Trizol 法提取受试者胚胎VT、DT 样本中的总RNA，用分光光度计测总RNA 纯度，根据逆转录试剂盒说明书将RNA 反转录为cDNA。参照SYBR Premix Ex TaqTM 试剂盒说明书进行qRT-PCR 反应，以GAPDH 基因为内参，BUB3 mNRA、BubR1 mNRA、GAPDH 引物序列见表1。反应条件为：95℃，10 min；40个PCR 循环（95℃，10 s；60℃，60 s；72℃，15 s）。采用2-ΔΔCt 方法计算样本中BUB3 mNRA、BubR1 mNRA 相对表达量。

1.3.4 蛋白免疫印迹（Western Blot）检测受试者组织中BUB3、BubR1 蛋白表达 将胚胎VT、DT 组织剪碎，加入蛋白裂解液，冰浴30 min，4℃，10 000 r/min，离心30 min，吸取上清液至EP 管。用BCA 法测定全细胞裂解液蛋白浓度，每孔取50 μg 进行SDSPAGE电泳，一抗（BUB3、BubR1抗体，稀释倍数1:500）孵育4℃过夜，羊抗兔二抗（1:10 000）室温孵育2 h，增强化学发光显色，采用Quantlty One 软件进行灰度值分析。

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用率表示，两组间比较采用χ2 检验；采用Logistic回归分析RM 发生的影响因素，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 qRT-PCR 引物序列

病例组的年龄、BMI、产次、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），病例组的孕次多于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 两组一般资料的比较（）

病例组VT、DT 中BUB3 mRNA、BubR1 mRNA 水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组和病例组VT 中BUB3 和BubR1 mRNA 水平均高于DT，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

表3 两组BUB3 mRNA、BubR1 mRNA表达的比较（）

 

与VT 比较，*P＜0.05

病例组VT、DT 中BUB3、BubR1 蛋白表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组和病例组VT 中BUB3 和BubR1 蛋白表达水平均高于DT，差异有统计学意义（P＜0.05）（表4，图1）。

表4 两组BUB3 及BubR1 蛋白表达的比较（）

 

与VT 比较，*P＜0.05

 

图1 两组BUB3 及BubR1 蛋白表达情况

以行流产手术孕妇是否发生RM 为因变量，以流产孕妇孕次、BUB3 mRNA、BubR1 mRNA 水平为自变量进行Logistic回归分析，孕次、BUB3 mRNA、BubR1 mRNA 为发生RM的危险因素（P＜0.05）（表5）。

表5 Logitic回归分析RM 发生的影响因素

RM是一种较为罕见的疾病，病因复杂，是目前基础与临床研究的难点和热点[9-10]。研究发现，细胞分裂过程中，SAC 能够监控细胞分裂中期全部染色体与纺锤体微管的连接情况，若SAC 相关基因表达异常，则会导致细胞分裂受到抑制或细胞染色体数目出现异常[5，11]。SAC 在细胞分裂中后期能够抑制细胞分裂周期基因20（cell division cycle gene 20，Cdc20）激活后期促进复合物/环体（anaphase-promoting complex/cyclosome，APC/C），使细胞保持于分裂中期，保证染色体与纺锤体正常连接，二者正确结合后，SAC 失活，APC/C-Cdc20 泛素化分离酶抑制剂及细胞周期蛋白B，使染色体正确分离，细胞分裂进入后期[12-13]。因此探讨胚胎细胞分裂过程中SAC 基因的表达，对探明流产发生的机制具有重要意义。

Wei 等[14]将BUB3、BubR1基因过表达以及采用RNA 干扰方法，分析SAC 复合物在小鼠胚胎中的作用。结果表明，过表达的SAC 成分通过阻止姐妹染色单体分离而抑制了细胞中期-后期的转变。RNA 干扰方法删除SAC 成分会加速第一次减数分裂过程中的中期-后期过度，并导致微核形成，染色体错位或非整倍性，造成胚胎发育迟缓，说明SAC 及其表达基因对卵裂期小鼠胚胎中有丝分裂细胞周期进程的调节至关重要。本研究结果显示，病例组VT、DT 中BUB3及BubR1 mRNA 和蛋白水平均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组和病例组VT 中BUB3 及BubR1 mRNA 和蛋白水平均高于DT，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示病例组BUB3 及BubR1 水平降低，造成SAC 复合物含量异常，胚胎细胞分裂过程中形成非整倍体细胞，且主要集中于滋养细胞胞浆内，可能具有VT 细胞特异性，最后产生致死性胚胎，从而导致流产。

有研究报道，缺失BUB3、BubR1或MAD2的小鼠有早产现象，因成纤维细胞内缺乏SAC，细胞表现为非整倍性[15]。Logistic回归分析结果显示，孕次、BUB3及BubR1 mRNA 均是发生RM的危险因素，提示孕次及BUB3 及BubR1 mRNA 与RM 发生有关。

综上所述，RM患者VT、DT中BUB3 及BubR1 mRNA 和蛋白水平均降低，且VT 中BUB3 及BubR1 mRNA 和蛋白水平均高于DT，BUB3 及BubR1 mRNA是RM的危险因素，可能对RM 有潜在预测价值。本研究存在研究方法单一，研究深度及影响因素不够丰富的不足，RM患者中BUB3 及BubR1的作用机制仍需进一步验证。

[1]中华医学会妇产科学分会产科学组.复发性流产诊治的专家共识[J].中华妇产科杂志，2016，51（1）：3-9.

[2]乌守恒，林卫.复发性流产与生殖道感染[J].实用妇产科杂志，2016，32（2）：85-86.

[3]Elkarhat Z，Kindil Z，Zarouf L，et al.Chromosomal abnormalities in couples with recur rent spontaneous miscarriage：a 21-year retrospective study，a report of a novel insertion，and a literature review[J].J Assist Reprod Genet，2019，36（3）：499-507.

[4]王文华，王晨阳，姜李乐，等.复发性流产染色体异常及影响因素分析[J].中国妇产科临床杂志，2018，19（4）：303-306.

[5]赵娟，李辉，覃亦伟，等.MAD1、BUB3 在非整倍体流产胚胎中的作用[J].临床和实验医学杂志，2017，16（4）：343-346.

[6]殷复粉，赵丽君，李小平，等.BUB1 基因在妇科恶性肿瘤中的研究进展[J].中国妇产科临床杂志，2019，20（2）：186-187.

[7]Overlack K，Bange T，Weissmann F，et al.BubR1 promotes Bub3-dependent APC/C inhibition during spindle assembly checkpoint signaling[J].Curr Biol，2017，27（19）：2915-2927.

[8]钟思霞.BUB1B 通过中心体分离途径引起多发性骨髓瘤增殖机制研究[D].南京：南京中医药大学，2020.

[9]Garrido-Gimenez C，Alijotas-Reig J.Recurrent miscarriage：causes，evaluation and management[J].Postgrad Med J，2015，91（1073）：151-162.

[10]Shahine L，Lathi R.Recurrent pregnancy loss：evaluation and treatment[J].Obstet Gynecol Clin North Am，2015，42（1）：117-134.

[11]Musacchio A.The Molecular Biology of Spindle Assembly Checkpoint Signaling Dynamics[J].Curr Biol，2015，25（20）：R1002-R1018.

[12]Williams SJ，Abrieu A，Losada A.Bub1 targeting to centromeres is sufficient for Sgo1 recruitment in the absence of kinetochores[J].Chromosoma，2017，126（2）：279-286.

[13]Miyazaki S，Kim J，Yamagishi Y，et al.Meikin-associated polo-like kinase specifies Bub1 distribution in meiosis Ⅰ[J].Genes Cells，2017，22（6）：552-567.

[14]Wei Y，Multi S，Yang CR，et al.Spindle assembly checkpoint regulates mitotic cell cycle progression during preimplantation embryo development[J].PLoS One，2011，6（6）：56-61.

[15]Zhang T，Qi ST，Huang L，et al.Cyclin B3 controls anaphase onset independent of spindle assembly checkpoint in meiotic oocytes[J].Cell Cycle，2015，14（16）：2648-2654.

Expression of BuB3 and BUBR1 in villus and decidual tissues of patients with recurrent miscarriage

ZHAO Juan1 LI Hui2 CHEN Guang-xin1 DU Li-jun1 ZHANG Xiao-li3 CAO Tian-sheng4▲
1.Department of Laboratory Medicine,Huadu District People′s Hospital of Guangzhou,Guangdong Province,Guangzhou 501800,China;2.Department of Internal Medicine,Huadu District People′s Hospital of Guangzhou,Guangdong Province,Guangzhou 501800,China;3.Department of Obstetrics and Gynecology,Huadu District People′s Hospital of Guangzhou,Guangdong Province,Guangzhou 501800,China;4.Department of Surgery,Huadu District People′s Hospital of Guangzhou,Guangdong Province,Guangzhou 501800,China

[Abstract]Objective To investigate the expression of BUB3 and Bub1 related proteins(BubR1)in the villus and decidual tissues of patients with recurrent miscarriage (RM)and their relationship with RM.Methods From March 2016 to March 2018,50 cases of missed abortion pregnant women in Huadu District People′s Hospital of Guangzhou were selected as the case group,and 50 cases of normal induced abortion women in the same period were selected as the control group.The age,body mass index(BMI),parity,total cholesterol(TC),triglyceride(TG),low density lipoprotein cholesterol(LDL-C),high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) were collected.The mRNA and protein levels of BUB3 and BuBR1 in embryonic villus tissue(VT)and decidual tissue(DT)were determined by real-time quantitative fluorescence PCR(qRTPCR) and Western blot (WB) Logistic regression was used to analyze the influencing factors of RM.Results There were no significant differences in age,BMI,parity,TC,TG,LDL-C and HDL-C levels between the two groups(P＞0.05).The mRNA and protein expression levels of BUB3 and BubR1 in VT and DT in case group were lower than those in control group,and parity was more than that in control group,and the differences were statistically significant (P＜0.05).Logistic regression showed that the parity (β=0.461,OR=1.586,95%CI=1.253-2.007),BUB3 mRNA (β=0.710,OR=2.035,95%CI=1.602-2.585) and BubR1 mRNA (β=1.304,OR=3.685,95%CI=2.884-4.708) were independent risk factors for RM (P＜0.05).Conclusion The mRNA and protein levels of BUB3 and BubR1 are reduced in VT and DT of patients with RM.BUB3 and BubR1 mRNA are independent risk factors for the occurrence of RM and may be potential diagnostic indicators for RM.

[Key words]Recurrent miscarriage;BUB3;Bub1 related protein;Villus;Decidual

[基金项目]广东省广州市卫生和计划生育科技项目（20181A 011113）；广东省广州市科技计划项目（201904010259）

[作者简介]赵娟（1984-），女，湖南人，硕士，副主任技师，研究方向：产前诊断、优生优育、遗传等

（收稿日期：2020-07-20）