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先天性白内障是一组由于晶状体混浊且通常发生在出生时或儿童早期的疾病，是一种常见的视觉障碍性眼病，为全球儿童可治疗性失明的首要原因[1-2]，据报道，其发病率在发展中国家明显高于发达国家，约为其10倍[3]。晶状体可表现有多种不同的混浊类型，如板层状、核性、粉尘状、蓝点状、花冠状、极性等[4]。据报道，约50%的先天性白内障与遗传因素有关[5]，其主要有3种不同的遗传方式：常染色体显性遗传（ADCC）、常染色体隐性遗传（ARCC）及X 连锁隐性遗传（XRCC），其中以ADCC 最为常见。同时有研究证实，先天性白内障具有明显的遗传异质性[6]。直到今天，已有超过40多个致病候选位点（http://omim.org/phenotypic-Series/PS116200）、200多个突变（https://cat-map.wustl.edu/）被报道与先天性白内障有关[7]。随着高通量测序技术的迅猛发展，越来越多的基因及突变位点被鉴定出与先天性白内障的发生相关，然而在这些突变位点中，大约50%位于编码晶状体蛋白的基因：CRYAA、CRYBA1/A3、CRYAB、CRYBA4、CRYBB1、CRYBB2、CRYGC、CRYGD和CRYGS[8]，1/4的突变来自于编码晶状体膜蛋白的基因GJA3和GJA8[9]。因而，这些基因被认为是先天性白内障的热点致病基因。本研究对1例先天性蓝点状白内障中国家系进行热点致病基因突变的进行筛查研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2017年9月收集黑龙江省一个先天性蓝点状白内障家系，包括先证者、其家系内其他2例已诊断明确的患者和2名与之有血缘关系的家系中正常成员。本研究首先对其进行全面的体格检查，排除其他眼部疾病及对其可能有影响的系统疾病。同时，从牡丹江医学院附属医院眼科门诊患者中随机选取50份无白内障的正常人外周血进行对照。所有实验对象均采集外周静脉血5 ml 置于EDTA 抗凝管中。本研究遵循《赫尔辛基宣言》，所有家系成员及对照者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 提取基因组DNA 使用血液DNA 提取试剂盒（TIANamp Blood DNA Kit，Tiangen Biltech）进行提取和纯化所有外周静脉血基因组DNA；使用1.5%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计来检测样本DNA 纯度及其浓度后-20℃保存备用。

1.2.2 设计候选基因特异性引物依据已报道的先天性白内障突变基因的筛查情况，本研究选取以往研究关注的热点致病基因及设计的引物序列[10]，所设计的引物覆盖热点基因的全部外显子区。

1.2.3 聚合酶链式反应（PCR）测序分析按SYBR R Green PCR Master Mix（TakaRa 生物工程公司提供）试剂盒制备实时定量PCR的反应体系，将合格有效的产物送到上海英骏生物技术有限公司进行纯化及DNA 序列测定。测序结果使用在线blast 软件进行分析，与美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库发布的基因碱基序列（参考基因组：NG_016242.1；转录本mRNA 序列版本号NM_005267.4）进行比对，以寻找碱基序列的改变。并查阅筛查GJA8，c.10T>C 在ESP 等各大数据库中的频率信息以排除多态位点。每个样本重复并正反向测序3 遍，如发现有碱基序列的改变并排除了该碱基是单核苷酸多态性的可能后，再将该位点与其余全部成员进行对比，以确定该碱基序列的改变在该家系中是否与该疾病是共分离的。

1.2.4 突变生物功能预测利用PolyPhen 生物信息学软件（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/）对氨基酸的改变对蛋白质功能及空间构象的影响进行预测。利用Misc Protein Analysis 软件（https://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=misc1）对突变氨基酸的二级结构和疏水性改变进行预测。利用NCBIProtein https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=GJA8获得不同物种GJA8的氨基酸序列，采用MegAlign 软件进行不同物种的保守性分析。

2 结果

2.1 该家系的临床表现

先天性白内障家系图如图1所示，经系谱分析其遗传方式为常染色体显性遗传；先证者眼前部检查图如图2所示，为晶状体蓝色点状混浊表型；家系中其他患病成员如其母亲及其外婆均已行白内障手术治疗，无图片提供。

图1 先天性白内障家系图

图2 先证者眼前部检查图

2.2 基因突变

PCR 测序分析该家系GJA8基因测序图如图3（封三）所示，结果显示，先证者及家系患者的GJA8基因发现了c.10T>C的杂合错义突变；家系内正常成员及正常对照者中未发现双峰样的杂合突变。GJA8氨基酸序列的多序列对比图如图4（封三）所示，比对数据显示，在许多物种中位于第4个氨基酸位置的色氨酸为高度保守序列，黑色矩形框所示。

图3 该家系GJA8基因测序图

A：先证者及家系患者；B：家系内正常成员及正常对照者

图4 GJA8氨基酸序列的多序列比对图

2.3 突变预测结果

PolyPhen 生物信息学软件的预测结果如图5（封三）所示，Cx50-W4R 得分为1.00，提示该突变可能为有意义的突变。Misc Protein Analysis 软件预测结果如图6（封四）所示，结果显示，先证者及家系患者p.W4R 突变改变了氨基酸链的正常二级结构，多增加了一个“转角”结构，如红色矩形框所示。突变氨基酸的疏水性预测图如图7（封四）所示，结果显示，先证者及家系患者蛋白质的疏水性明显降低，影响其跨膜结构和溶解度，进而改变蛋白质的功能和自我聚集[11]，如红色矩形框所示。

图5 突变预测结果图

3 讨论

已有研究表明，人类第一个定位于常染色体上的疾病是遗传性先天性白内障，其致病基因位点突变会导致先天性白内障的发生。本研究在对一例先天性蓝点状白内障患病家系进行致病基因突变筛查时，发现了GJA8基因的c.10T>C的杂合错义突变，导致第4位高度保守的色氨酸改变为精氨酸（p.W4R），从而揭示了该家系的遗传学缺陷。

缝隙连接蛋白（connexin，Cx）是重要的细胞膜蛋白，对于细胞间的信号传导，转运物质能量和代谢产物等具有重要的作用[12]。晶状体是一种无血管结构，其主要依靠Cx43、Cx46和Cx50 介导的细胞间通讯来维持晶状体的稳态和透明度[13]。Cx50 蛋白在晶状体上皮细胞和晶状体纤维细胞内皆有表达[11]，由GJA8基因进行编码，其主要功能是在细胞间运输离子及小分子物质。Cx50 蛋白经过了4次的跨膜，形成了一个胞质内环、两个细胞外环（E1、E2）以及位于该胞质内的C-末端和N-末端，相邻的细胞外环之间通过相互作用形成连接子，相邻两个细胞间的连接子再通过相互连接构成细胞间的缝隙连接通道。本研究通过测序及序列对比分析发现GJA8基因的c.10T>C的杂合错义突变，导致第4位高度保守的色氨酸改变为精氨酸（p.W4R），并发现该突变体位于胞质内的N-末端。Oh等[14]通过研究发现Cx N-末端可以影响跨界电压依赖性门控的灵敏性。Musa 等[15]的实验也说明了Cx N-末端可能形成一个关键的细胞质成孔区域，作为跨界电压依赖的受体被细胞内多胺封闭和阻断。另外，还有研究表明，N-末端在渗透性方面也发挥着关键作用[16]。所以在本研究中，笔者认为该突变体可能改变N-末端结构，影响其发挥正常的功能作用。据报道，主要定位于细胞质中的Cx50 R23T 突变体会破坏缝隙连接的电导，影响细胞间的通讯，这可能是因为带正电荷的精氨酸（R）转变为不带电荷的极性氨基酸苏氨酸（T）[17]。因此，笔者怀疑Cx50 W4R 也可能是由于不带电荷的极性氨基酸精氨酸（W）被带正电荷的氨基酸（R）取代造成的。Cx50分布结果表明，Cx50 W4R 影响Cx50 在亚细胞中的分布和转运到质膜，从而不能形成正常的半通道。因此，功能失调性缝隙连接可能是Cx50 突变体导致白内障的一种可能机制.

此外，Zhang 等[18]通过靶向外显子测序发现GJA8基因的c.10T>A的杂合错义突变也会导致第4位高度保守的色氨酸改变为精氨酸（p.W4R），这与本实验研究的主要不同之处在于突变碱基的不同，但结果都为导致了同样的氨基酸改变，并进一步促进了白内障的发生。这种变异符合致病变异分级中的同一密码子改变导致相同氨基酸改变这一标准[19]，并且本研究通过PolyPhen 预测分析结果显示该氨基酸与致病性变异有关，因此，进一步提示该致病基因突变为强致病性突变，为该家系的遗传学致病原因之一。但这是否与不同的白内障表型相关联，还有待进一步研究。

综上所述，GJA8基因发生c.10T>C的杂合错义突变，导致第4位高度保守的色氨酸改变为精氨酸（p.W4R）。该突变拓展了先天性白内障GJA8基因突变谱，促进了先天性白内障的研究进展，为研究寻找基因治疗靶点提供了新的方向。

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