外周神经损伤后其后续影响及功能恢复的病理生理过程十分复杂，神经组织的修复过程相对缓慢、再生生理较差[1]，而且损伤后发生局部粘连、组织萎缩和运动终板退化可能性较大，进而导致神经功能的损伤修复受到影响，是目前显微外科重点与难点问题[2]。干细胞移植作为当今显微外科神经修复治疗的新型手段，骨髓间充质干细胞（BMSCs）是目前较为实用的种子细胞，尤其在外周神经损伤修复过程中发挥重要作用[3]。虽然其临床应用较为广泛，但其仍存有一定不足，如体外培养归巢率低，移植后细胞存活能力欠佳等[4]。注射用富血小板纤维蛋白具有较高的促生长因子释放率，从而更有效地诱导BMSCs 的生产与分化[5]。为更好地提高外周神经损伤的修复治疗效果，本研究通过对大鼠应用自体注射型富血小板纤维蛋白联合BMSCs 进行治疗，现报道如下。

DMEM 培养基由美国HyClone 公司提供（生产批号：20180201），十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）配胶试剂盒由上海碧云天生物科技公司提供（生产批号：201811058），CKX41型倒置相差显微镜由日本奥林巴斯公司提供，7000型透射电镜由日本东芝公司提供。

选择10日龄SD 乳鼠6只，雌雄各半，体重为25～35 g；另外选择2月龄SD 大鼠24只，雌雄各半，体重195～225 g；均购自沈阳医学院实验动物中心（合格证号：20191105）。本研究造模及入组动物选择均通过实验动物伦理委员会审核同意，SD 大鼠常温下适应性饲养1 周备用。

1.3.1 大鼠BMSCs 及注射型富血小板纤维蛋白的制备 取6只乳鼠采用离颈法处死，采集由DMEM 培养基从双侧胫骨干骺端冲洗骨髓，离心管反复吹打制备细胞悬液，随后严格按照密度梯度离心法进行细胞分离、培养和传代，选择培养3 周后第4 代纯化BMSCs群备用。注射型富血小板纤维蛋白以改良低速离心法进行，具体通过SD 大鼠眼眶采血法采集自体血，置于低速离心管内离心3 min后获取浆液层与红细胞层中间的富血小板纤维蛋白层，所制备富血小板纤维蛋白无需抗凝，但要求在制备成功后15 min 内应用。

1.3.2 分组治疗 将24只2月龄SD 大鼠随机分为观察组与对照组，各12只，以改良挤压损伤法制作大鼠坐骨神经损伤模型，先注射3%戊巴比妥实施腹腔麻醉，随后双侧后肢脱毛，无菌条件下对实验侧坐骨神经止血钳上齿挤压45 s，将坐骨神经积压呈扁薄状即为模型制备成功。造模后，观察组与损伤部位局部注射BMSCs 悬液250 μl 及自体富血小板纤维蛋白250 μl，对照组局部注射生理盐水500 μl，治疗14 d后进行相关结果分析。

1.3.3 观察指标 比较治疗前后两组坐骨神经功能指数变化情况；分析两组治疗14 d后大鼠坐骨神经轴突透射电镜图像结果；统计两组治疗14 d后腓肠肌湿质量变化情况。坐骨神经功能指数为监测神经损伤后恢复情况的一种无创检测手段，以训练小鼠沿限定轨迹走动，并通过后爪不同颜色无毒染料印迹为标准，记录治疗前及治疗14 d后两组实验大鼠沿轨迹行走指标，结合爪长度、脚趾展开长度等综合计算，计算公式选择Bain 公式进行，具体为SFI=109.5（ETSNTS）/NTS-38.3（EPL-NPL）/NPL+13.3（EIT-NIT）/NIT-8.8（N：正常足；E：伤侧足；PL：足印长度；TS：足趾宽度；IT：中间足趾宽度；）,其中SFI=0 为正常，SFI=-100为完全损伤；腓肠肌湿质量指标包括：健侧与实验侧腓肠肌湿质量数据，并计算腓肠肌湿质量恢复率，通过十万分之一精度电子天平秤测定治疗14 d后双侧腓肠肌湿质量，腓肠肌湿质量恢复率=实验侧（g）/正常侧（g）×100%。

采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较使用独立样本t 检验，组内比较使用配对t 检验，组间率的比较采用χ2 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

治疗前两组坐骨神经功能指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），治疗后两组坐骨神经功能指数低于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05）；且治疗后观察组坐骨神经功能指数低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 两组治疗前后坐骨神经功能指数变化的比较（±s）

两组大鼠坐骨神经透射电镜提示有髓鞘轴突比例情况提示，治疗14 d后，大鼠坐骨神经透射电镜提示观察组髓鞘轴突比例高于对照组（图1~2）。

 

图1 对照组治疗14 d后大鼠坐骨神经轴突透射电镜图（400×）

 

图2 观察组治疗14 d后大鼠坐骨神经轴突透射电镜图（400×）

治疗后两组健侧腓肠肌湿质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后观察组实验侧腓肠肌湿质量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗后观察组腓肠肌湿质量恢复率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 两组治疗14 d后腓肠肌湿质量变化情况的比较（±s）

神经组织损伤后虽具有一定的组织重塑能力，但随着微环境的改变为出现不可逆性改变[6]，进而导致神经修复与再生能力被抑制，给目前临床上针对外周神经损伤的修复其仍属于治疗难点[7]。以往治疗上多以神经电刺激等进行治疗，虽具有一定效果[8]，但整体疗效有待提高。近年神经支架、种子细胞及神经营养因子等生物工程手段的临床应用，为神经组织修复带来巨大突破[9]。

针对外周神经损伤，本研究制备大鼠坐骨神经损伤模型，其中观察组使用自体注射型富血小板纤维蛋白联合BMSCs 进行治疗，结果显示，治疗前两组坐骨神经功能指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后观察组坐骨神经功能指数低于同组治疗前及对照组治疗后，差异有统计学意义（P＜0.05）。证明针对大鼠坐骨神经损伤模型，使用自体注射型富血小板纤维蛋白联合BMSCs 进行治疗，相对于注射生理盐水的对照组，能更好地促进坐骨神经功能指数的提高，促进坐骨神经功能的恢复。治疗14 d后，大鼠坐骨神经透射电镜提示观察组有髓鞘轴突比例高于对照组（P＜0.05），提示自体注射型富血小板纤维蛋白联合BMSCs在治疗大鼠坐骨神经损伤方面，促进损伤神经轴突再生具有重要意义。治疗14 d后，观察组腓肠肌湿质量高于对照组，且观察组腓肠肌湿质量恢复率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），进一步说明针对大鼠坐骨神经损伤模型，自体注射型富血小板纤维蛋白联合BMSCs 治疗对促进平滑肌细胞增殖、血管形成等具有重要价值。

BMSCs 是一种具有自我更新、多向分化和分泌功能的多能干细胞[10]，以旁分泌集落刺激因子、干细胞生长因子、内皮细胞生长因子等多种细胞因子进而调节机体炎症反应，达到促进细胞修复，组织形成的目的[11-12]。另外，本研究使用的自体富血小板纤维蛋白联合BMSCs在神经局部鞘内注射，更好地为神经修复提供充足营养，并在15 min 内注射，避免了凝胶状态[13]，加大组织流动性，提高了临床应用效果；而且通过其释放的碱性成纤维细胞生长因子，显著提高BMSCs增殖与分化能力，并促进神经细胞的黏附、迁移效应，提高细胞外基质蛋白水平，进而更好地诱导BMSCs 增殖与分化[14-16]，促进平滑肌细胞与血管的形成，确保神经组织血管的重塑与增殖，达到修复受损神经的目的[17-18]。

综上所述，针对坐骨神经损伤大鼠，使用自体注射型富血小板纤维蛋白联合BMSCs 进行治疗，能有效提高坐骨神经功能，促进神经修复，提高平滑肌与血管再生能力。

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Experimental study of injection platelet-rich fibrin combined with BMSCs on sciatic nerve injury

YE Fang WANG Yan-sheng YU Ning XU Hui▲
The Fifth Department of Hand Surgery,Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College,Liaoning Province,Shenyang 110000,China

[Abstract]Objective To investigate the application effect of injection platelet-rich fibrin combined with Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) on sciatic nerve injury.Methods A total of 6 cases 10-day-old SD suckling rats of either sex were cultured and purify BMSCs group for later use,and 24 2-month-old SD rats half male and half female of either sex were selected,and 24 cases 2-month-old SD rats were randomly divided into observation group and control group,each had 12 cases.A rat sciatic nerve injury model was established by modified extrusion injury method.BMSCs suspension 250 μl and autologous platelet-rich fibrin 250 μl were locally injected into the observation group and the injury site,and 500 μl of normal saline was locally injected into the control group.Then the changes of sciatic nerve function index before and after intervention were compared between the two groups.The result of transmission electron microscope images of sciatic nerve axons of rats were analyzed 14 days after treatment of the two groups.The changes of wet quality of gastrocnemius muscle in 14 days after intervention in the two groups were counted.Results Before treatment,there was no significant difference in sciatic nerve function index between the two groups (P＞0.05);after treatment,the sciatic nerve function index of the observation group was lower than that before treatment and of the control group,the difference was statistically significant (P＜0.05); after 14 days of treatment,the rat sciatic nerve transmission electron microscope showed that the ratio of myelin axons in the observation group was higher than that in the control group,the wet mass of the gastrocnemius in the observation group was higher than that in the control group,and the recovery rate of the wet mass of the gastrocnemius in the observation group was higher than that in the control group,the differences were statistically significant (P＜0.05).Conclusion For sciatic nerve injury rats,the use of autologous injection platelet-rich fibrin combined with BMSCs for treatment can effectively improve sciatic nerve function,so it can promote nerve repair and improve smooth muscle and vascular regeneration.

[Key words]Injection platelet-rich fibrin; Bone marrow mesenchymal stem cells; Sciatic nerve injury; Regeneration capacity

[中图分类号] R965.1

[文献标识码] A

[文章编号] 1674-4721（2020）11（a）-0009-04

[基金项目]沈阳医学院科技基金项目（20191012）

（收稿日期：2020-05-13）