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动脉粥样硬化性脑梗死是严重危害人类健康的全球性疾病，然而目前各类人群的发病风险仍然无法准确预测[1]。动脉粥样硬化性脑梗死表现出很强的遗传易感性，不同基因型人群对该病的易感性不同。我们通过筛查该病的易感基因，可对易感人群进行早期预警。核因子κB 受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）基因rs9533156 位点多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的关系在国内人群中尚未开展过研究，本研究旨在探讨RANKL 基因rs9533156 位点多态性与动脉粥样硬化性脑梗死发病的相关性。RANKL 是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族重要的成员之一。RANKL 基因属于Ⅱ型跨膜蛋白，人RANKL 基因位于染色体13q14，是破骨细胞分化和活化的重要细胞因子，表达于成骨细胞或基质细胞表面[2]。RANKL 能刺激趋化因子释放、单核巨噬细胞基质迁移和基质金属蛋白酶活性，在动脉粥样硬化中起着重要作用[3]。Biscetti 等[4]研究发现在意大利人群中RANKL 基因rs9533156 多态性显著（55.0%比36.5%，P＜0.0001），与缺血性脑卒中的发病独立相关，RANKL 的遗传变异是缺血性脑卒中独立风险因素。由此推断RANKL 基因rs9533156 多态性与中国辽宁汉族人群脑梗死的易感性也可能相关。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年3月～2018年7月就诊于中国医科大学附属盛京医院神经内科诊断为动脉粥样硬化性脑梗死的213 例患者作为病例组，男142 例，女71例，年龄45～70 岁。纳入标准：①符合第四届全国脑血管病学术会议制定的诊断标准及改良TOAST 分型标准[5]（因发病机制的不同，选择发病率最高的大动脉粥样硬化型进行研究）；②影像学检查[头磁共振成像（MRI）+磁共振血管造影(MRA)、颈部血管彩超]支持以上诊断。排除标准：①伴脑出血的脑梗死者；②小动脉闭塞型脑梗死者；③心源性脑栓塞者；④血管畸形或动脉炎所致的脑梗死者；⑤有严重心、肝、肾功能不全者；⑥肿瘤、自身免疫性疾病者。选取同期同医院体检中心的健康体检者197 例作为对照组，男112 例，女85例，年龄45～70岁，排除标准同病例组。入选对象均为辽宁汉族人，彼此间无亲缘关系，签署知情同意书后进行血样采集，均符合盛京医院伦理委员会制定的伦理学标准。

1.2 方法

所有入选者空腹抽取静脉血2 ml 加入EDTA-2K 抗凝管中，使用天根血液DNA 提取试剂盒（天根生化科技北京有限公司）按说明书的步骤提取，提取出的DNA 采用PCR 技术进行目的基因片段的扩增，再应用改良多重连接酶反应技术对rs9533156 位点进行基因分型。PCR 及连接引物由上海天昊生物有限公司设计（表1）。连接产物上ABI3730XL 测序仪（北京龙跃生物科技发展有限公司），测序仪上收集的原始数据采用GeneMapper 4.1（Applied Biosystems，USA）软件进行分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析。用卡方检验进行Hardy-Weinberg 平衡分析，明确样本是否具有群体代表性。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t 检验。计数资料的组间比较采用χ2 检验。采用Logistic 回归分析研究基因型与动脉粥样硬化性脑梗死的相关性，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基因型分布及等位基因频率

病例组和对照组的SNP 位点均满足Hardy-Weinberg 平衡（χ2=1.371，P=0.242），说明该样本具有良好的群体代表性。RANKL 基因rs9533156 位点的三种基因型为TT、CT、CC。以TT 为参照，CT 和CC 基因型在病例组和对照组中的Logistic 分析结果差异无统计学意义（P＞0.05）。以等位基因T 为参照，等位基因C 在病例组和对照组中的Logistic 分析结果差异无统计学意义（P＞0.05）（见表2）。

2.2 两组显性模型和隐性模型RANKL-rs9533156 基因型的比较

显性模型和隐性模型分析显示，两组RANKLrs9533156 基因型比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

表1 RANKL-rs9533156 PCR 引物及连接引物

表2 两组RANKL-rs9533156 基因型分布及等位基因频率的比较[n（%）]

a：P 值和OR（95%CI）用年龄进行调整；ref：以1.00 为参考

表3 两组显性模型和隐性模型RANKL-rs9533156 基因型的比较

a：P 值和OR（95%CI）用年龄进行调整

3 讨论

多种类型的细胞都可表达RANKL，例如破骨细胞、活化的T/B 细胞、骨髓基质细胞、乳腺上皮细胞等[6]。研究表明[7]，RANKL 对骨重建、乳腺发育、T/B 细胞的早期分化、淋巴结形成、体温调节等重要生理过程发挥调节作用，同时还参与了乳腺癌的发生、肿瘤骨转移、骨质疏松、关节炎等病理过程。Sassi 等[8]研究发现在绝经后的突尼斯妇女中，RANKL 基因-643C/T的多态性与骨质疏松的风险具有相关性。Yang 等[9]研究发现RANKL 基因rs2277438 多态性增加了类风湿性关节炎的发病风险。Petean 等[10]研究发现RANKL基因rs9594738 多态性与持续性根尖周炎发病显著相关。Shaker 等[11]研究发现RANKL 基因多态性与乳腺癌的发病风险及预后密切相关。Mrozikiewicz-Rakowska 等[12]研究发现RANKL 基因rs9533156 多态性与糖尿病足的发病相关。SaiPrathiba 等[13]研究发现RANKL 基因-643C/T 与2 型糖尿病合并神经病变单独显著相关。Wang 等[14]研究发现RANKL 基因单倍型rs7984870C/rs9533155G/rs9525641C 与强直性脊柱炎敏感性呈负相关。Biscetti 等[4]已经证实在意大利人群中RANKL 基因rs9533156 多态性与缺血性脑卒中发病显著相关。

本研究结果显示：在中国辽宁汉族人群中RANKL 基因rs9533156 多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的发病无相关性。得出的结论不同首先可能是因为基因多态性与疾病的关系在不同种族中存在着差异。意大利人群属于欧洲白种人，辽宁汉族人群属于亚洲黄种人，基因多态性本身存在种族和地域的差异性，研究得出的结论可以不同。例如路甲鹏等[15]研究发现，欧洲西部和北部后裔、中国北京汉族人、日本东京人，尼日利亚的约巴鲁人4 个种群中，盐敏感性高血压易感基因多态性的分布有着显著差异。其次本研究为单中心病例对照研究，样本量相对较小，结果可能出现偏倚。应继续收集样本，多中心跨地域收集，以便做进一步的研究，反复验证结论的准确性。

[参考文献]

[1]Xue QZ，Mong AG，Wang T，et al.Correlation between of small dense low-density lipoprotein cholesterol with acute cerebral infarction and carotid atherosclerotic plaque stability[J].J Clin Lab Anal，2019，33（6）：e22891.

[2]Yamagishi T，Kawashima H，Ogose A，et al.Expression profiling of receptor-activator of nuclear factor-kappa B ligand in soft tissue tumors[J].Tohoku J Exp Med，2019，248（2）：87-97.

[3]Zavaczki E，Gáll T，Zarjou A，et al.Ferryl hemoglobin inhibits osteoclastic differentiation of macrophages in hemorrhaged atherosclerotic plaques[J].Oxid Med Cell Longev，2020，2020：3721383.

[4]Biscetti F，Giovannini S，Straface G，et al.RANK/RANKL/OPG pathway：genetic association with history of ischemic stroke in Italian population[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2016，20（21）：4574-4580.

[5]Zhang H，Li Z，Dai Y，et al.Ischaemic stroke etiological classification system：the agreement analysis of CISS，SPARKLE and TOAST[J].Stroke Vasc Neurol，2019，4（3）：123-128.

[6]Greene ND，Stanier P，Copp AJ，et al.Genetic of human neural tube defects[J].Molecular Genetics，2009，18（R2）：R113-129.

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[8]Sassi R，Sahli H，Cheour E，et al.-643C>T RANKL gene polymorphism is associated with osteoporosis in Tunisian postmenopausal women[J].Climacteric，2017，20（4）：374-378.

[9]Yang H，Liu W，Zhou X，et al.The association between RANK，RANKL and OPG gene polymorphisms and the risk of rheumatoid arthritis：a case-controlled study and metaanalysis[J].Biosci Rep，2019，39（6）：BSR20182356.

[10]Petean IBF，Küchler EC，Soares IMV，et al.Genetic Polymorphisms in RANK and RANKL are Associated with Persistent Apical Periodontitis[J].J Endod，2019，45（5）：526-531.

[11]Shaker OG，Senousy MA.Association of SNP-SNP interactions between RANKL，OPG，CHI3L1，and VDR genes with breast cancer risk in egyptian women[J].Clin Breast Cancer，2019，19（1）：e220-e238.

[12]Mrozikiewicz-Rakowska B，Nehring P，Szymański K，et al.Selected RANKL/RANK/OPG system genetic variants in diabetic foot patients[J].J Diabetes Metab Disord，2018，17（2）：287-296.

[13]SaiPrathiba A，Senthil G，Juttada U，et al.RANKL gene polymorphism as a potential biomarker to identify acute charcot foot among indian population with type 2 diabetes：A preliminary report[J].Int J Low Extrem Wounds，2019，18（3）：287-293.

[14]Wang CM，Tsai SC，Lin JC，et al.Association of genetic sariants of RANK，RANKL，and OPG with ankylosing spondylitis clinical features in Taiwanese[J].Mediators Inflamm，2019，2019：8029863.

[15]路甲鹏，张玲，王玮，等．盐敏感性高血压易感基因多态性的种族差异性研究[J]．中华心血管病杂志，2010，38（10）：943-948．