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最近研究表明，同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）处于高水平是导致冠状动脉病变的独立危险因素[1-2]。作为Hcy 代谢的关键酶亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetrahy drofolate reductase，MTHFR）基因常在677位发生错义突变，导致该酶的活性下降，引起Hcy 水平上升。有研究发现，该基因是心血管疾病发生的危险因素[3-4]。本研究选取冠心病（coronary heart disease，CHD）患者作为研究对象，通过分析MTHFR C677T基因多态性和等位基因频率，进一步探索MTHFR C677T 基因多态性和血浆Hcy 水平的相关性以及MTHFR C677T 基因多态性与CHD 发病的相关性，从遗传角度为CHD 的发病机制及诊疗提供新的方法，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年12月～2019年10月于阜新市第五人民医院和锦州医科大学附属第一医院住院和门诊就诊的经冠状动脉造影确诊的153 例CHD 患者作为CHD 组，同时收集149 例健康体检者作为对照组。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有试验均符合伦理准则，并获得研究对象或亲属的知情同意。CHD 诊断标准：中华医学会急性非ST 段抬高型急性冠脉综合征诊断和治疗指南及急性ST 段抬高型心肌梗死诊断与治疗指南中颁布的急性冠脉综合征诊断标准[5-6]。

1.2 方法

1.2.1 实验室检测方法采集空腹12 h 以上外周静脉血至于EDTA 抗凝，血浆-80℃冻存待测Hcy，血细胞作提取DNA 用。Hcy 通过酶循环法测定（上海科华卓越生化分析仪），检测试剂批号：14030403（北京中生公司）。通过全自动生化仪（BeckmanDXC800）测定血脂、肾功能、血糖指标。

1.2.2 DNA 检测方法采用人外周血DNA 提取试剂盒（德国QIAGEN 公司，批号：52904），提取人基因组DNA，采用Nano Drop 检测基因组DNA 浓度。基因组DNA置于-80℃贮存。应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术检测MTHFR 基因单核苷酸多态性（C-T）。PCR 引物为：上游5′-AGGCCC TATGGTAGTGCCTTT-3′，下游5′-TCTCTTAGTGCTGTG GTCAC-3′。PCR 体系为：基因组DNA 模板100 ng，上下游引物各2 μl，2×PCR MIX 25 μl，用ddH2O 补足至50 μl。PCR 反应温度设置如下：94℃变性8 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，34 个循环，72℃延伸8 min，PCR 产物4℃贮存。

1.3 统计学方法

所有统计学资料由Epi data 软件整理录入，采用SPSS 16.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（

±s）表示，两两比较采用LSD-t 检验；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2 检验。基因型频率的分布采用Hardy-Weinberg 平衡χ2 检验；应用Logistic 回归分析CHD 患病的危险因素，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTHFR 基因酶切结果

MTHFR 基因型酶切后电泳结果显示三种结果：CC 基因型、CT 基因型、TT 基因型。PCR 目的片段为246 bp，利用HinfI 内切酶对246 bp 的目的片段进行酶切，含C 等位基因为246 bp，T 等位基因被HinfI 酶切成两条片段，分别为174 bp 和72 bp。MTHFRC677T基因多态性符合Hardy-Wenberg 平衡，具有群体代表性。

2.2 两组MTHFR 基因C677T 基因型的比较

CHD 组的CC 基因型、C 等位基因频率占比低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；CHD 组的CT基因型占比与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；CHD 组的TT 基因、T 等位基因频率所占比例高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 两组MTHFR 基因C677T 基因型的比较[n（%）]

2.3 两组受试者不同基因型临床资料的比较

对照组和CHD 组不同基因型研究对象的年龄、糖尿病、高血压、吸烟和生化指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。在CHD 组不同基因型中，Hcy 水平在CC 基因型中最低，在TT 基因型中最高（P＜0.01）。在对照组中，不同基因型的Hcy 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

2.4 不同基因型患CHD 的Logistic 回归分析

不同MTHFR 基因C677T 基因型患CHD 的Logistic 回归分析显示，TT 基因型为患CHD 的独立危险因素（OR＝4.388，95%CI：2.091～5.695，P＜0.01），而CC基因型为CHD 的独立保护因素（OR=0.590，95%CI：0.393～0.921，P＜0.01）（表3）。

3 讨论

在Hcy 的代谢途径中，5,10-亚甲基四氢叶酸还原到5-甲基四氢叶酸的反应中，黄素依赖酶MTHFR作为关键酶之一参与到上述还原反应中。MTHFR C677T 点突变，使MTHFR 氨基酸结构发生改变，进而影响MTHFR 的活性[7]。Hcy 通过促进低密度脂蛋白氧化，加速激活血小板聚集，使血管内皮受损，进而引起一系列心血管事件的发生[8]。Hcy 水平受MTHFR 活性的影响，当C677T 发生突变时可引起MTHFR 活性改变。国外研究认为，未发生MTHFR 基因突变的患者其血浆Hcy 水平明显低于发生突变的患者，等位基因的分布频率也与高水平的Hcy 具有显著相关性[9-10]。本研究结果显示，MTHFR 基因型有三种：CC 基因型、CT 基因型、TT 基因型；MTHFR C677T 基因多态性符合Hardy-Wenberg 平衡，具有群体代表性；CHD 组的TT 基因、T 等位基因频率所占比例高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。CHD 组中，Hcy 水平在CC基因型中最低，在TT 基因型中最高（P＜0.01），TT 基因型Hcy 水平高于CC 基因型和TC 基因型（P＜0.05）。在对照组中，Hcy 水平在各个不同基因型中未见明显差异（P＞0.05）。因为Hcy 代谢受MTHFR 活性的影响，当TT 基因型发生突变时会使MTHFR 活性下降导致Hcy 水平升高。高Hcy 血症一个重要的遗传因素是MTHFR 基因纯合突变。MTHFR 的三种基因型中，对酶活性影响最大的为TT 基因型。通过对37℃时CC 与TT 基因型发生突变时的酶活性比较，当TT基因型发生突变时，其酶活性降低明显，仅为CC 型的50%左右[11]。CT 基因型发生突变时酶活性也同样降低，其酶活性的下降程度居中。本研究可得出与上述一致的结论。由于Hcy 特殊的临床意义，故可在有条件的情况下通过检测患者MTHFR C677T 基因多态性来实现疾病的早期预防、治疗，同时在指导个体化用药方面同样具有重要意义。

表2 两组受试者不同基因型临床资料的比较（

±s）

TC：总胆固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇

表3 不同基因型患CHD 的Logistic 回归分析

血浆Hcy 水平受基因及环境因素共同影响。由于MTHFR 基因发生突变，使MTHFR 酶活性降低，与叶酸结合能力下降[12-13]，同时，叶酸、维生素B12 缺乏也可使Hcy 升高[14]。通过对MTHFR 遗传学的深入研究，人们发现该基因存在多种突变类型，常见的包括MTHFR G1793A、MTHFR T1317C、MTHFR C677T、MTHFR A1298C 等[15]，在蛋白质表达过程中TT 型形成了酶的不耐热表型，热稳定型为TC 型。目前关于MTHFR 基因多态性的研究众多，且结论众说纷纭，由于基因具有种族和民族的差异，所以会造成具有差异性的研究结果。荷兰的Almawi 等[16]对Hcy 水平与MTHFR C677T 基因多态性相关性进行分析，结果表明，Hcy 水平升高及T 等位基因增加同样增加CHD的患病率。Sarecka-Hujar 等[17]研究发现，在波兰人群中拥有TT 基因型并且吸烟者患早发CHD 的风险明显高于CC 基因型且不吸烟者（OR=24.62），认为TT基因型是波兰人群早发CHD 的重要危险因素。于善花等[18]发现CHD 的发生与MTHFR C677T 位点错义突变相关联。Li 等[19]的研究中，MTHFR C677T TT 基因型的急性冠状动脉综合征（ACS）患者比其他两个基因型有更严重的冠状动脉病变。本研究结果显示，CHD 组中TT 基因型个体血浆Hcy 水平高于其他两基因型个体，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组中TC 杂合型与CC 纯合型Hcy 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。因此，Hcy 水平受MTHFR 基因型影响，当MTHFR 发生突变时影响CHD 的患病率。TT 基因型为患CHD 的独立危险因素，CC 基因型为CHD的独立保护因素（P＜0.05）。因此，在心血管疾病的遗传分析研究中，可将MTHFR 基因的遗传变异广泛使用[20]。

综上所述，CHD 比较复杂，可能与基因型、环境因素、种族[21]等有关。Hcy 升高及其代谢酶（MTHFR）C677T 基因多态性可能与发生CHD 有关，TT 基因型可能为该人群易感基因型。然而，由于本研究样本例数偏少，结果难免存在一定偏差，有待更大规模的研究揭示该基因与CHD 的关系。

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