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血虚证是临床常见的病症，多数原因为失血过多、脾胃虚弱，或者血液生化之源不足以及瘀血阻滞等。目前国内研究人员造模采用较多的是慢性放血，使其“有形之血不能速生”，配合疲劳、饥饿等方式损伤其中焦脾胃，造成脾虚、气虚，使血液生化之源匮乏而制作出接近临床血虚证表现的小鼠动物模型，充分弥补了早期通过放化疗损伤这个单一因素造模不能全面反映中医血虚证候复杂的病理变化的缺陷。但该中医证候动物模型没有统一标准的造模参数，造成研究者重复实验时需要重新摸索参数，浪费大量时间和精力。本研究通过对比力竭运动时间（游泳时间）及放血体积的不同参数对小鼠体重、免疫器官指数、死亡率、血常规指标、血清白细胞介素-6（IL-6）水平及红细胞膜Na+-K+-ATP 酶活性的影响，确定血虚证的最优造模参数，现报道如下。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物及分组

实验用ICR 小鼠[上海斯莱克实验动物有限责任公司；生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005]100 只，雄性，6 周龄，体重（25±1）g，于浙江省医学科学院动物实验中心饲养，室内温度（22±2）℃，相对湿度30%～40%，各组小鼠喂食常规饲料，自由饮水。ICR 小鼠经适应性饲养1 周后，随机分为正常对照组与4 个不同参数模型组（模型组A、B、C、D），每组各20 只。实验在浙江省医学科学院动物医学伦理委员会批准下进行。

1.2 试剂及仪器

ATP 酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）；IL-6 Elisa 试剂盒（美国R&D 公司）；库尔特细胞全自动分析仪（美国Becman 公司）。

1.3 造模方法

小鼠适应性饲养后，每日模型组4 组小鼠置于自制塑料盒（50 cm×120 cm×40 cm）中强迫游泳10 min或15 min，水温20℃，隔日眼眦取血0.3 ml 或0.5 ml，实验期间饲料控制在每日75 g/kg，连续9 d，制成血虚证模型。其中模型组A（n=20）：15 min 游泳+0.3 ml放血；模型组B（n=20）：10 min 游泳+0.3 ml 放血；模型组C（n=20）：15 min 游泳+0.5 ml 放血；模型组D（n=20）：10 min 游泳+0.5 ml 放血。

1.4 取材及检测

于造模后第10 天，对各组小鼠进行股动脉取血，除了抗凝全血外，1500 r/min 离心10 min，取得血清做生化测定，处死动物后取胸腺和脾脏称重。

取抗凝全血加入血细胞分析仪中上机直接进行血常规分析，主要测定红细胞、白细胞、血小板以及血红蛋白数量。

将肝素钠抗凝全血4℃离心（1500 r/min，10 min），吸去上清液并小心吸去压积红细胞上层的白色绒毛状膜成分。将压积红细胞用10 倍体积的4℃生理盐水悬浮，4℃离心（1500 r/min，10 min），重复2～3 次。直到上清液无色，吸去上清液，保留压积红细胞。取压积红细胞按1∶10 比例加入去离子水，混匀混合。4℃放置20 min，由于出现溶血现象，液体由鲜红色变为透明暗红色。4℃平衡离心（12 000 r/min，30 min），吸去暗红上清液，可见底部一块粉红色沉淀，重复3 次，直到沉淀部分呈乳白色，弃去上清液及离心管底部褐色的纤维蛋白样沉淀斑，收集白色或浅粉色血影膜。将血影膜悬浮于一定体积的去离子水中，混合均匀，用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。规定每小时每107个红细胞的Na+-K+-ATP 酶分解三磷酸腺苷（ATP）产生1 μmol 无机磷的量为一个Na+-K+-ATP 酶活性单位，即μmol Pi/（107 个红细胞·h）。按ATP 酶试剂盒说明书测定红细胞膜Na+-K+-ATP 酶活性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 11.5 统计学软件进行数据分析，符合正态分布计量资料的均数用均数±标准差（

±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，不符合正态分布者经过变量转换为正态分布后行统计学分析；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义，以P＜0.01 为统计学差异极显著。

2 结果

2.1 各组小鼠的一般状况

外观变化可以清楚地反映小鼠的进食、饮水、饲养等情况。在实验造模期间内，模型组A、B、C、D 的小鼠外观均发生了比较明显的变化，如耳廓鼻唇颜色变浅、皮毛不光泽、精神萎靡、腰背团缩、动作灵敏度降低等。

2.2 各组小鼠体重、免疫器官指数和死亡率的比较

模型组A、B、C、D 小鼠的初始体重与正常对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组A、B、C、D小鼠造模9 d 后的体重均低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。模型组A、B、C、D 小鼠造模9 d后的体重比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组A、B、C、D 小鼠的免疫器官指数（胸腺指数和脾脏指数）均低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。模型组A、B、C、D 小鼠造模9 d 后的胸腺指数和脾脏指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组A、C 和D 小鼠造模9 d 后死亡率高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组B 小鼠造模9 d 后死亡率与正常对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组B 小鼠造模9 d 后死亡率低于模型组A、C 和D，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 各组小鼠体重、免疫器官指数和死亡率的比较（

±s，n=20）

与正常对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组B 比较，*P＜0.05

2.3 各组小鼠血常规指标的比较

模型组A、B、C、D 小鼠造模9 d 后的红细胞、白细胞、血红蛋白以及血小板计数均低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。模型组A、B、C、D 小鼠造模9 d 后的血常规指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 各组小鼠血常规指标的比较（

±s，n=20）

与正常对照组比较，#P＜0.01

2.4 各组小鼠血清IL-6 水平和红细胞膜Na+-K+-ATP 酶活性的比较

表3 各组小鼠血清IL-6 水平和红细胞膜Na+-K+-ATP 酶活性的比较（

±s，n=20）

与正常对照组比较，#P＜0.01

模型组A、B、C、D 小鼠造模9 d 后的血清IL-6水平和红细胞膜Na+-K+-ATP 酶活性均低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。模型组A、B、C、D 小鼠造模9 d 后的血清IL-6 水平和红细胞膜Na+-K+-ATP 酶活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

3 讨论

中医认为肝藏血，具有贮藏血液、调节血量及防止出血的功能；脾统血，具有统摄、控制血液在脉中平稳运行，防止血液溢出脉外的功能，如《金匮要略》所述“五脏六肺之血，全赖脾气统摄。”失血会引起肝脏萎缩，藏血功能失常；脾脏萎缩，统摄血液功能失常；胸腺萎缩，免疫功能低下，从而表现为血虚的证候。血虚证动物模型研究目前有失血性（综合失血法）、化学损伤[1-2]、放射性损伤[3-4]和免疫介导[5-6]4 类模型。通过中医学的定义和古籍文献的描述可知，血虚多由失血、劳倦、饮食不足等原因引起，故本研究采用综合放血法（力竭游泳+放血+限食），符合血虚证中医证候的病因。经过每日观察记录发现模型组小鼠在造模后的第3 天即出现行动迟缓，团缩弓背，面、眼、耳、尾苍白而凉，毛蓬竖而少光泽，血色暗红，大便稀等典型血虚症状。

通过整理文献报道的综合放血法致血虚模型，发现造模参数差异较大，有每日强迫力竭游泳20 min+隔日放血0.3 ml[7]、也有隔日游泳20 min+隔日放血0.4 ml[8-10]、隔日游泳20 min+隔日放血0.3 ml 以及每日游泳2 次（时长不定）+隔日放血0.5 ml 等，对新的研究者的参考意义并不大。本研究通过设置不同的力竭游泳时间和放血量，考察体重、免疫器官指数、死亡率、血常规指标、血清IL-6 水平及红细胞膜Na+-K+-ATP 酶活性对比血虚模型的造模程度，结果显示，模型组A、B、C、D 小鼠造模9 d 后的体重及免疫器官指数均低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。红细胞为运送氧气的主要媒介且具有免疫功能，血红蛋白含量高低代表着血虚程度的轻重，白细胞为免疫细胞，具有吞噬异物产生抗体的作用，而血小板在造血过程中也发挥重要作用。本研究结果显示，模型组A、B、C、D 小鼠造模9 d 后的红细胞、白细胞、血红蛋白以及血小板含量均低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），说明血虚小鼠的红细胞运输功能受到损伤，机体免疫水平低下，与其他研究者的结论较为一致[11-13]，并且随着造模参数的变化，造模严重程度也加重。免疫细胞因子IL-6 可诱导活化后的B 细胞对免疫球蛋白（Ig）的分泌，同时促进T 细胞的活化增殖、分化，尚能与IL-3 协同诱导多种造血前体细胞的增殖，而兴奋体液免疫系统，同时对细胞免疫和造血功能也有促进作用。本研究结果显示，模型组A、B、C、D小鼠造模9 d 后的血清IL-6 水平低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），与免疫器官指数、白细胞水平降低均一致，说明血虚证小鼠具有免疫力低下的状况[14]，与其他研究者的结论一致[5]。红细胞膜结构和功能的完整是红细胞发挥作用的重要保证，而红细胞的功能主要是通过膜蛋白来实现的，细胞膜上的Na+-K+-ATP 酶保持膜内高钾，膜外高钠的平衡，能将ATP 分解为二磷酸腺苷（ADP）并产生能量，对维持红细胞的形态和功能具有重要作用，但在血虚状态下其活力明显降低。本研究结果显示，模型组A、B、C、D 小鼠造模9 d 后Na+-K+-ATP 酶活性低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），与其他研究者的结论一致[15-20]。4 种造模参数下都能够成功制作出血虚模型，且4 个模型的评估指标无显著差异。本研究结果显示，模型组A、C 和D 小鼠造模9 d 后的死亡率高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示造模过严重会导致模型小鼠死亡率的大幅度增加。小鼠的死亡原因均为当晚被同笼相对较强的小鼠咬死并食用，因此模型组A、C 和D 无法达到每日限食75 g/kg的精确实验条件，为实现造模方法的标准化且具有可重复性，在4 组模型都造模成功的基础上，优先考虑模型组B 的造模参数，即每日强迫力竭游泳10 min+隔日放血0.3 ml。

目前对于中医证候模型血虚证判定成模的标准基本都以现代医学的客观指标为基础，并根据阳性结果来判定，但对于这些客观指标的特异性和权重并没有深入研究，只有确定权重系数和量化指标的重要性，才能使得中医证候模型更切合临床实际情况和更具有可重复性，可在下一步研究中深入探讨。

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