Article Info

定点诱变是体外特异性地取代、插入或缺失DNA 序列任何一个特定碱基的技术[1]。近几年来定点诱变技术发展迅速，不仅用于基因和蛋白功能的基础研究，还用于反向遗传学改造，主要方法包括重叠PCR 法、长引物PCR 法、环状定点诱变技术和酶介导的诱变等技术[2-7]。重叠PCR 法、长引物PCR 法和酶介导的诱变技术操作复杂，费事费力；环状定点诱变技术操作简单，诱变效率高，倍受广大研究者青睐[5-7]。该技术利用PCR 扩增引入目标突变，经甲基化酶DpnI消化原始质粒，宿主内进行修复和环化，高效产生目标质粒[6-7]。药物开发为提高药物的生物学活性、半衰期、特异性和安全性，对药物分子进行定向改造不可避免[8-10]。环状定点诱变技术在单碱基突变中的应用广泛，本研究探讨该技术在酶切位点插入、替换和删除基因片段等突变类型中的应用，为生物药物研发过程中的载体构建提供方法学基础。近几年来，随着基因编辑和基因疗法的兴起[11-12]，环状定点诱变技术在前期核酸改造中也发挥着不可或缺的作用。本研究旨在探讨环状定点诱变技术在目标质粒单碱基突变，酶切位点修改和片段删除中的应用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 供试品

pUC57-7NB2AA 质粒（金斯瑞生物科技有限公司；订单编号：C8100EI120）；pET26b-7NB2AA（华兰生物自我构建保存原核表达质粒）。

1.2 材料

B528413 型DH5α 大肠感受态和A505255 型琼脂粉（生工生物工程股份有限公司）；LP0042 型蛋白胨（赛默飞世尔科技公司）；212750 型酵母粉（Becton Dickinson 公司）；1161B 型NdeI、1010B 型BamHI、1160B 型NcoI、1094A 型Xho I 和1235A 型DpnI 内切酶（宝日医生物技术有限公司）；AP211 型EasyPfu DNA Polymerase （北京全式金生物技术有限公司）；K0502 型Gene JET Plasmid Miniprep Kit（赛默飞世尔科技公司）。

1.3 仪器设备

HYG-A 型全恒温摇瓶柜（太仓实验设备厂）；1-15PK 型台式离心机（赛多利斯公司）；SW-CJ-2FD型洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；S100型PCR 反应扩增仪（BIO-RAD 公司）；WD-9403C 型紫外仪、DYY-10C 型电泳仪和DYCP-31DN 型电泳槽（北京六一生物科技有限公司）；Alpha Imager HP 型凝胶成像系统（Protein Simple 公司）；Nano Drop ONE型微量分光光度计（赛默飞世尔科技公司）。

1.4 定点诱变实验流程

1.4.1 引物设计原则

引物包含预期突变序列且位于互补区域中间，突变两侧至少10 bp，引物5’端含有5～8 bp 突出碱基（图1）。

图1 环状定点诱变PCR 引物设计示意图

F 和R 分别表示相应引物碱基，M 表示拟突变位点，|表示碱基配对

1.4.2 定点诱变

以环状质粒作为模板PCR 扩增，甲基化酶DpnI酶消化1 h，取消化产物5 μl 转化DH5α 感受态，涂板过夜培养，挑单克隆培养、提取质粒、鉴定目标克隆。

1.4.2.1 PCR 扩增按照拟突变质粒1 μl，引物F（10 μM）1 μl，引物R（10 μM）1 μl，dNTP（2.5 mM）4 μl，Easypfu Buffer 5 μl，Easypfu Buffer 1 μl，补水至50 μl 的反应体系；94℃预变性4 min，94℃变性30 s，（Tm-5）℃退火30 s，72℃延伸（扩增长度/500）10 min，4℃最后保温反应条件进行PCR 扩增30个循环。扩增产物经DpnI 消化后即可用于转化。

1.4.2.2 DpnI 消化原始质粒扩增PCR 产物需要经过DpnI 甲基化酶去除拟突变质粒，反应体系为DpnI 1 μl，T Buffer 5 μl，PCR 反应产物5 μl，补水至50 μl；反应条件为37℃孵育1 h。甲基化酶消化原始质粒后，取5 μl 反应体系，转化DH5α 即可完成克隆构建，待鉴定。

1.5 酶切鉴定

按照Gene JET Plasmid Miniprep Kit 试剂盒说明书提取质粒。内切酶A 0.25 μl，内切酶B 0.25 μl，双酶切缓冲液1 μl，待鉴定质粒1 μl 定反应体系，37℃酶切1 h 进行酶切鉴定。点样5 μl 酶切反应体系进行核酸电泳鉴定，判断克隆是否为阳性。阳性克隆送样测序验证定点诱变实验结果。

2 结果

2.1 单碱基突变

为了提高7NB2AA 药物候选分子与其配体之间的亲和力，利用分子模拟软件Discovery Studio 建模分析。模型显示7NB2AA 分子A102 为关键位点，需要进行A102V（GCT→GTT）单氨基酸突变。设计引物7NB2AA-F：AAACAGGCAAGATTG

TGACTAC AACT，7NB2AA-R：GTTTGTAGTTGTAGTCA

CAATC TTG（

标记代表拟突变位点）。金斯瑞合成pUC57-7NB2AA 质粒为模板扩增目的序列，DpnI 消化去除原始质粒，转化DH5α，提取质粒，酶切鉴定、测序分析。结果显示，酶切鉴定4 个克隆中，其中3 个为阳性克隆，送样测序鉴定，序列和预期结果一致（图2、图3，封四）。环状定点诱变技术进行基因单碱基定点突变高效可行。

图2 药物候选分子7NB2AA 单碱基诱变酶切鉴定图

M 表示MarkerDL10000；1～4 表示药物候选分子7NB2AA 突变后NcoI 和Xho I 双酶切

图3 药物候选分子7NB2AA 单碱基诱变测序峰图（见内文第33 页）

202001 为原始7NB2AA 测序峰图，202001M 为突变后7NB2AA 测序峰图

2.2 酶切位点修改

信号肽后前6 个氨基酸决定信号肽酶切割效率，对周质空间分泌表达至关重要[13]。为了优化药物候选分子7NB2AA 周质空间表达，对信号肽后酶切位点进行改造。原始载体pUC57-7NB2AA 的PelB 信号肽后为NcoI 酶切位点，编码MG 两个冗余氨基酸残基，+1蛋氨酸侧链较大，不利于周质空间表达。利用环状定点诱变技术对其进行改造，删除NcoI 酶切位点和修改为BamHI 小侧链氨基酸（GS）。使用表1 引物，pUC57-7NB2AA 质粒为模板扩增目的序列，DpnI消化去除原始质粒，转化DH5α，提取质粒，酶切鉴定、测序。结果显示，挑选克隆均为阳性，测序序列与预期一致，环状定点诱变技术高效可行（图4、图5，封四）。酶切位点修改在载体改造和表达量优化中使用频繁。本研究通过环状定点诱变技术可以高效、快速实现酶切位点删除和替换。

图5 药物候选分子7NB2AA 表达优化酶切位点修改测序峰图（见内文第34 页）

2020002 为原始质粒，200202MNcoI 为NcoI 酶切位点删除克隆，200202MBamHI 为BamHI 位点替换克隆

表1 酶切位点修改引物序列

方框表示拟突变的BamHI 酶切位点

图4 药物候选分子7NB2AA 表达优化酶切位点修改酶切鉴定图

M 代表MarkerDL 10 000，1～4 代表NcoI 位点删除克隆，5～8 为BamHI 替换NcoI 位点克隆，阴性为原始pUC57-7NB2AA 质粒

2.3 片段删除

载体构建中片段删除是分子生物学的常规操作。以7NB2AA 蛋白表达质粒为例，环状定点诱变技术将其PleB 信号肽去除，改为胞内表达质粒。设计引物7NB2AA-sig-F：AAGAAGGAGATATACATATGCAGGT GCAACTGCAG，7NB2AA-sig-R：CTTTCCTGCAGTTG CACCTGCATATGTATATCTCC。pET26b-7NB2AA 质粒为模板扩增目的序列，DpnI 消化切除原始质粒，转化DH5α，提取质粒，酶切鉴定、测序鉴定。结果显示，酶切鉴定有阳性克隆，送样测序鉴定显示PelB 信号肽成功删除（图6、图7，封四）。本研究证明环状定点诱变技术删除基因片段可行。

图6 pET26b-7NB2AA 信号肽删除酶切鉴定图

M 代表MarkerDL 10 000，1～7 代表信号肽去除克隆NdeI 和XhoI 双酶切；8 为原始pET26b-7NB2AA 质粒，NdeI 和XhoI 双酶切

图7 pET26b-7NB2AA 信号肽删除测序峰图（见内文第34 页）

2020003 为pET26b-7NB2AA 周质表达质粒，200203MSig 为信号肽去除的胞内表达质粒

3 讨论

环状定点突变技术多用于单碱基突变，酶切位点修改和片段删除报道较少。本研究扩展了该技术在生物医药领域的应用范围：①抗体药物Fc 结构N297A，L235E 和M428L/N434S 等突变改善抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）[14]；②去除药物研发筛选技术（单B 细胞筛选技术[15]）的冗余酶切位点，加快药物研发进程； ③去除药物开发早期目标蛋白携带的His6、HA 或GFP 等标签[16]，促进药物研发早期活性评价。本研究环状定点诱变技术删除的PelB 信号肽长度仅为63 bp，理论可以实现更长片段的删除（笔者在XTEN 融合蛋白技术研究中成功删除1728 bp 的片段）；此外，技术可以实现连续1～6 个碱基的任意突变，理论可以实现更长碱基对发突变（限制因素为引物合成长度），下一步研究拟证明该技术的最长突变极限。

本研究验证了环状定点突变技术在单碱基突变中应用的可行性。此外，本研究证明该技术可进行质粒的酶切位点删除、替换和基因片段删除等突变。环状定点突变技术高效改造蛋白药物关键氨基酸，去除的冗余酶切位点和蛋白药物的冗余标签，在生物药研发中备受青睐。

[参考文献]

[1]王秋颖.基因体外定点诱变技术[J].山西农业大学学报，2007，27（6）：124-126.

[2]Dong M，Wang F，Li Q，et al.A single digestion，single -stranded oligonucleotide mediated PCR-independent sitedirected mutagenesis method[J].Appl Microbiol Biotechnol，2020，104（9）：3993-4003.

[3]Forloni M，Liu A，Wajapeyee N.Altered beta-Lactamase Selection Approach for Site-Directed Mutagenesis[J].Cold Spring Harb Protoc，2018，2018（8）：670-676.

[4]Xia Y，Li K，Li J，et al.T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis[J].Nucleic Acids Res，2019，47（3）：1-11.

[5]曹阳，李冬田，尹冰楠，等.重叠延伸PCR 方法的建立与应用[J].河北医药，2005，27（11）：803-804.

[6]刘玉冰，李晓霞，王宝利，等.一步PCR 法在单碱基定点诱变中的应用[J].天津医科大学学报，2007，13（1）：98-99.

[7]周亚芹，张洪梅，董艳，等.环状定点诱变技术在单碱基定点诱变中的应用[J].现代医学，2009，37（5）：321-324.

[8]Crisci S，Amitrano F，Saggese M，et al.Overview of Current Targeted Anti-Cancer Drugs for Therapy in Onco-Hematology[J].Medicina（Kaunas），2019，55（8）：414.

[9]Qu G，Li A，Acevedo-Rocha CG，et al.The Crucial Role of Methodology Development in Directed Evolution of Selective Enzymes[J].Angew Chem Int Ed Engl，2020，59（32）：13 204-13 231.

[10]Sayous V，Lubrano P，Li Y，et al.Unbiased libraries in protein directed evolution[J].Biochim Biophys Acta Proteins Proteom，2020，1868（2）：140 321.

[11]She W，Ni J，Shui K，et al.Rapid and Error-Free Site-Directed Mutagenesis by a PCR-Free In Vitro CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenic System[J].ACS Synth Biol，2018，7（9）：2236-2244.

[12]Kanazashi Y，Hirose A，Takahashi I，et al.Simultaneous site-directed mutagenesis of duplicated loci in soybean using a single guide RNA[J].Plant Cell Rep，2018，37（3）：553-563.

[13]WatanabeK，TsuchidaY，OkibeN，etal.ScanningtheCorynebacterium glutamicum R genome for high-efficiency secretion signal sequences[J].Microbiology，2009，155（Pt 3）：741-750.

[14]Wang X，Mathieu M，Brezski RJ.IgG Fc engineering to modulate antibody effector functions[J].Protein Cell，2018，9（1）：63-73.

[15]Wardemann H，Busse CE.Expression Cloning of Antibodies from Single Human B Cells[J].Methods Mol Biol，2019，1956：105-125.

[16]Strain-Damerell C，Burgess-Brown N.High-Throughput Site-Directed Mutagenesis[J].Methods Mol Biol，2019，2025：281-296.