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金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是骨科植入物相关感染的主要致病细菌[1]。SA 可通过植入物植入或一过性的菌血症等途径黏附于植入物材料表面并形成细菌生物膜（bacterial biofilm，BBF）[2]。BBF是包裹在自身产生的聚合物基质中，并黏附在植入物或组织细胞等宿主表面上的，具有高度结构化的细菌群体[3]。BBF 由细菌及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）组成，其中细菌约占15%[4]。迄今为止，对于BBF 相关感染仍然没有明确有效的治疗方法[5]。SA 是BBF 相关感染的主要致病细菌[6]，对SA 的BBF 形成过程进行研究有助于对SA 相关感染的防治提供思路[7]。Lohse 等[8]认为，目前对BBF 形成过程的研究主要是基于体外实验、感染的动物体内模型以及临床医疗设备上形成的BBF 的观测，在这些观测的基础上，BBF 的形成过程大致被分为4 个阶段，分别为黏附、增殖、成熟及播散。

1 黏附

SA 黏附于宿主表面是SA 引发骨科植入物相关感染的起始动因[9]。目前，对于SA 如何黏附并定植于宿主表面的详细机制并不完全清楚。Lohse 等[8]发现，SA 中参与群体感应（quoromsensing，QS）的分子、宿主表面的性质、宿主中的激素以及其他相互作用的微生物的存在均可影响黏附阶段的完成。

1.1 SA 的黏附过程

当浮游状态的SA 游动到宿主表面时，会黏附在其表面。这一初始黏附过程需依靠范德华力、疏水性、表面电荷和表面张力等作用力来完成，但同时需克服SA 与宿主表面的排斥力[10]。因此，这一初始黏附过程是选择性的、可逆的、不稳定的[11]。一旦浮游SA 完成在组织细胞等宿主表面的初始黏附，镶嵌在SA 表面肽聚糖上的一些分泌蛋白，如细胞外黏附蛋白和细胞壁锚定蛋白等黏附分子可以介导SA 进一步黏附在组织细胞表面；细胞外黏附蛋白和细胞壁锚定蛋白的缺失可以显著降低BBF 的坚固性和厚度，但是这些蛋白之间的功能关系尚不清楚[12]。Grimm 等[13]认为细菌表面的黏附分子能与组织细胞内的胶原蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白和纤连蛋白等结合；然后，细菌开始从周围环境中摄取营养物质并交换DNA，于是细菌发生特异的不可逆黏附。另外，人体内的血浆蛋白等大分子物质能吸附在植入物等宿主表面，这能为浮游细菌的黏附提供基质，有助于浮游细菌在植入物等宿主表面形成牢固的黏附[14]。

1.2 黏附过程中的调控机制

SA 具有广泛且冗余的毒力基因库，能够在逃避宿主免疫应答的同时黏附并定植和破坏宿主[15]。有专家认为，在黏附过程中，细菌与组织细胞内的胶原蛋白的结合能力主要是由Pil1 基因调控[13]，而此结合能力是细菌毒性的重要特征。在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）形成BBF 时，黏附过程参与的基因很多，在众多的基因中，fnbA、clfA、clfB 或cna 等是介导MRSA 完成黏附阶段所必需的基因[16]。另有研究表明，巨噬细胞能分泌溶菌酶，细菌中的mccF、cinA 等与免疫相关的基因在溶菌酶的触发作用下会表现出高表达，溶菌酶能刺激细菌在人体内更快速地形成BBF[13]。还有专家认为，多种细菌的共生存在也会相互激发从而促进BBF 的形成[9]。黏附后的SA 聚集在一起，会产生QS系统等调控机制；QS 系统是细菌监测菌群分布并感知周围培养环境的重要机制，主要受agr 等基因控制；SA 通过QS 系统介导特定基因的表达，从而调控SA 的行为[17]。

2 增殖

2.1 ECM 中的成分

SA 黏附于宿主表面后开始大量分泌ECM。ECM的主要成分是胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）、多糖胞间黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA）和蛋白质等，其中每种成分的量随菌株和培养条件的不同而不同[12]。eDNA 来自细菌的裂解产物，其对于细菌与宿主的初步黏附很重要，并有助于维持BBF结构。有专家认为，在ECM 中，eDNA 是最常见的成分[6]，或许可以将eDNA 作为针对SA 的BBF 根除策略的主要目标。但是eDNA 的含量与BBF 形成能力之间不相关，eDNA 在BBF 形成和结构完整性方面的作用可能取决于PIA 等基质的含量和作用。PIA 是由icaADBC 操纵子编码的蛋白质执行生物合成而产生，是细菌聚集和形成BBF 的主要生物分子[18]。在ECM中，PIA 具有很重要的作用，能介导细菌分泌胞外多糖等黏液成分，并能促使细菌之间相互聚集、增加细菌与宿主之间黏附的牢固程度、抵御机体的免疫反应和抗生素的侵袭[19]。据报道，MRSA 常产生不依赖PIA的BBF，该类BBF 含有较多的eDNA，并且对脱氧核糖核酸酶Ⅰ治疗敏感[6]；相反，PIA 依赖性BBF 通常产生于对甲氧西林敏感的SA 中，其含有较少的eDNA，并且对脱氧核糖核酸酶Ⅰ具有抗性。目前，ECM 中各种成分的作用及其在不同菌株BBF 中的关系尚未完全清楚[6]。

2.2 增殖过程中的调控机制

黏附在宿主表面的SA 会聚集在一起，快速生长，并在QS 系统的引导下分泌ECM。ECM 的产生取决于培养环境和控制BBF 形成的调节因子的功能改变[4]。涉及ECM 形成的调控机制很复杂。据报道，细胞外蛋白酶（Aur，SpL，SspA 和SspB）、热核酸酶（Nuc）、自溶素（LytM，LytN 和AtlA）、毒素（PSMα，PSMβ 和δ-溶血素）、穴蛋白/抗霍乱分子（CidA 和LrgAB）、双组分系统（Agr，WalKR，LytSR，SaeRS，ArlRS 和SrrAB）、全局调节因子（SigB，SarA，MgrA 和Rot）和非编码RNA（msaABCR）都直接或间接调节ECM 形成，其中起调节作用的必须因子是SigB[4]。SigB 是在调节SA 的BBF形成、毒力表达和色素合成中起重要作用的转录调节因子，当SigB 的表达增加时SA 形成BBF 的能力增强，而sigB 缺失的突变体则不能形成BBF。

3 成熟

3.1 BBF 的成熟过程

在成熟过程中，ECM 可将SA 包裹在一起，形成蘑菇状的小菌落。这些小菌落在化学信号分子的引导下形成水通道和气孔等复杂结构，用以运送SA 新陈代谢所需的酶、营养物质和代谢产物等，并进一步加强BBF 内细菌之间的联系，产生协调的群体行为。有研究显示，在小菌落形成水通道和气孔等结构的过程中，酚溶性调控蛋白（phenol-soluble modulins，PSMs）是起重要作用的效应分子[20]。PSMs 是一种表面活性剂，能破坏ECM 中大分子间的起静电或疏水作用的非共价键。在PSMs 的作用下，一些细菌与细菌之间的黏附会逐渐被瓦解，进而形成微孔道。成熟后的BBF 中的ECM 的主要成分是糖蛋白。Lohse 等[8]发现，通过质谱法已经在ECM 中鉴定出500 多种蛋白质，许多是酶，其中的一些酶缺乏规范的分泌序列，不太可能是细菌分泌的酶，而可能是细菌的裂解产物。

3.2 成熟后的BBF 的生理状态

成熟后的BBF 内的SA 的生理状态会发生显著变化。Archer 等[21]发现，在BBF 的成熟过程中，BBF 内的氧气、营养物质和电子受体的梯度变化会导致整个BBF 的异质基因表达。在SA 的体外BBF 模型中，SA有4 种不同的代谢状态，即需氧、发酵、休眠和死亡的SA。大多数SA 处于休眠状态并处于缺氧环境中，但暴露于含氧的空气界面和富含营养素的液体界面的SA 具有显著的代谢活性。这种现象可能是由于密集的细菌和ECM 的屏障作用，使得在BBF 里层的细菌营养供给不足，生长速度受到限制所致。当发生机体免疫反应和抗生素侵袭导致BBF 外周环境中的浮游细菌减少时，BBF 里层的处于休眠状态的细菌便可复苏和释放到外周环境中，形成新的感染灶。BBF 的代谢活动受到表面环境条件和诱导黏附的特定基因表达的控制，低细胞代谢能增加SA 对抗生素的抗性[22]。BBF 的抗生素耐受性也与抗生素敏感SA 的同基因亚群的出现有关，这些SA 由于随机诱导的休眠状态而获得对多种抗生素的耐受性[6]。因此，当人体组织细胞或骨科植入物等宿主表面上有成熟的BBF 形成时，其常引起慢性感染。

4 播散

成熟后的BBF 中的细菌逐渐增多而变得拥挤。当SA 密度达到一定阈值时便会触发信号转导，部分SA 就会从BBF 中解离出来，重新变成游离状态进行远处播散。成熟后的BBF 在相关基因的调控下会分泌表面活性剂或细胞外酶等物质，个别细菌或小菌落可以通过这些物质自我调动和从BBF 中解离脱落，重新变成浮游细菌，并寻找新的环境，重新繁殖并扩大BBF 的规模，使之不断成熟。BBF 的解离方式可能有多种，其中常见的可能有两种，具体如下。①生物解离：成熟后的BBF 会分泌多种细胞外酶，如半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶等。这些细胞外酶能够降解ECM 中的蛋白成分，破坏SA间的黏附，使得BBF 稳定性下降。然而，敲除这些细胞外酶的基因能明显抑制BBF 的解离过程[23]。②化学解离：诸如PSMs 之类的表面活性剂能破坏ECM 中大分子之间的非共价键从而使BBF 解离。这一阶段是BBF 维持感染并进一步扩散感染的重要环节，所以这一阶段在BBF 形成过程中，特别是慢性感染机制中尤为重要。

5 总结与展望

SA 的BBF 的形成过程涉及多种基因、蛋白质以及复杂的调控机制。目前，对SA 的BBF 的形成过程和调控机制的研究尚未完全清楚[17]，如镶嵌在SA 表面肽聚糖上的细胞外黏附蛋白和细胞壁锚定蛋白等黏附分子在BBF 的形成和致病性中具有独特作用。目前，这些蛋白之间的功能关系并不清楚。然而，研究清楚这些蛋白之间的功能关系可能为控制SA 的BBF 感染提供新的策略[12]。icaA 和icaD 基因能通过介导PIA 的合成确定SA 产生BBF 的能力，这表明ica 基因位点有可能是治疗SA 引起的植入物相关感染的良好靶标[7]，值得进一步研究。总而言之，深入研究SA 的BBF 形成过程可能有助于对SA 的相关感染进行治疗，尤其是慢性感染的治疗。

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