盐酸地芬尼多片收载于《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）2015年版二部[1]，用于防治多种原因引起的眩晕、恶心、呕吐，属甲类非处方药（over the counter，OTC）品种，入选国家基本药物目录[2]。原研片生产厂家是日本新药工业株式会社，该药于20世纪80年代由湖南千金湘江药业有限公司率先仿制成功，目前其片剂市场占有率达70%。2016年5月，国家食品药品监督管理总局发布“关于落实《国务院办公厅关于开展仿制药质量和疗效一致性评价的意见》有关事项的公告”明确规定盐酸地芬尼多片在公布的2018年底须完成仿制药一致性评价289个品种目录位列95号。除体外溶出一致性外[3]，有关物质一致性也是仿制药质量一致性评价的重要组成部分[4-7]。目前盐酸地芬尼多片有关物质方面已有的研究[8-13]主要是国内仿制片杂质的情况，并没有分析原研片的有关物质，且没有进行两者对比分析其有关物质情况，无法判断仿制品与原研品有关物质是否具有一致性。本研究收集了国内市场上该品种的几个批次产品和原研片，参照国家发布的《化学药物杂质研究技术指导原则》和《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》及相关文献资料[14-16]，对盐酸地芬尼多片、原研片按照《中国药典》[1]收载的质量标准测定了有关物质，分析其有关物质情况。

Ultimate3000高效液相色谱仪（配有DIONEX二极管阵列检测器，赛默飞世尔科技有限公司）；MS205DU电子分析天平（感量为0.1 mg和0.01 mg，

梅特勒-托利多有限公司）。

盐酸地芬尼多（湖南千金湘江药业有限公司，批号：160311）；盐酸地芬尼多片，仿制企业（湖南千金湘江药业有限公司，规格：25 mg/片，批号：160305、160306、160307；广西大海阳光药业有限公司，批号：170201、170901；江苏四环生物制药有限公司，批号：1612071、1702161；山东仁和堂药业有限公司，批号：160501、160901）；盐酸地芬尼多片，原研（日本新药工业株式会社，规格：25 mg/片，批号：381501、381601、381701）；盐酸地芬尼多对照品（中国食品药品检定研究院，批号100841-201303，含量：99.6%），盐酸地芬尼多杂质Ⅰ（烯化合物）对照品（中国食品药品检定研究院，批号101133-201101，含量：99.7%），甲醇（色谱纯，Honeywell）。

采用《中国药典》2015年版二部[1]收载的盐酸地芬尼多片检测有关物质方法[16]，条件如下。色谱柱：Aglient plus C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：0.5%三乙胺溶液（用磷酸调节pH值至4.0）-甲醇（44∶56）；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃；检测波长：210 nm；进样量：20μl；记录时间为盐酸地芬尼多主峰保留时间的4倍。

2.2.1 供试品溶液 取研细的盐酸地芬尼多片粉末（约相当于25 mg盐酸地芬尼多），精密称定，置50 ml量瓶中，加流动相适量，振摇使盐酸地芬尼多溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液。

2.2.2 对照溶液 另取杂质Ⅰ对照品12.5 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质Ⅰ对照品溶液；精密量取2 ml及“2.2.1”下供试品溶液1 ml，置同一100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，续滤液作为对照溶液。

2.2.3 空白辅料溶液 取不含主药成分按处方比例制备的空白片（湖南千金湘江药业有限公司提供），按“2.2.1”供试品溶液配制。

分别取“2.2”项下的空白辅料溶液、供试品溶液及对照溶液，按“2.1”项有关物质测定方法，进样测定，记录色谱图。

称取空白辅料1.0 g，两份，分别加入1.5和4.0 ml的对照溶液，按“2.2”项下的供试品溶液制备法操作，进样测定，计算信噪比（S/N），基于S/N为3和10时分别计算检出限与定量限。

取酸破坏试验的样品溶液，分别考察“2.1”项下的色谱条件波长变化±2 nm、柱温变化±5℃、流速变化±20%、流动相pH值变化±0.2和流动相比例甲醇变化±2%时，杂质检出情况变化。

取“2.2”项下的供试品溶液和对照溶液在室温下放0、3、6、12、18 h，分别进样，考察主峰面积及杂质峰面积变化情况。

精密称取12.11 mg杂质Ⅰ置于50 ml量瓶中，加流动相稀释溶解，定容至刻度，摇匀。再分别精密量取0.2、0.4、1、2、4、10、20 ml溶液置于100 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，进样分析。以峰面积（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，进行线性回归分析。

取湖南千金湘江药业有限公司的盐酸地芬尼多片剂（批号：160307）研细粉，精密称定6份，照“2.2”项下配置溶液，共6份，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算杂质Ⅰ的含量及相应的相对标准偏差（RSD）。

由不同的实验人员，采用不同的仪器与色谱柱，按照“2.2”项下配置溶液，共6份，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算杂质Ⅰ的含量，并结合重复性试验结果一起计算相应的RSD。

称取空白辅料约0.125 g，6份，各加入“2.2”项下的杂质Ⅰ对照品溶液1 ml，依法配制6份溶液，进样测定。记录色谱图，计算回收率。

根据稳定性试验指导原则[17-18]，取盐酸地芬尼多原料药、空白辅料、仿制片（湖南千金湘江药业有限公司提供）及原研片细粉各适量（相当于250 mg盐酸地芬尼多），精密称定，分别置于100 ml量瓶中，加流动相适量，振摇使盐酸地芬尼多溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为贮备液；分别精密量取上述各贮备液2 ml，①加1 mol/L盐酸溶液0.8 ml，置40℃水浴中放置0.5 h，最后再加1 mol/L氢氧化钠溶液调至中性；②加1 mol/L氢氧化钠溶液0.8 ml，置60℃水浴中放置1 h，最后再加1 mol/L盐酸溶液调至中性；③经4500LX光照24 h；④加30%过氧化氢溶液0.8 ml，置水浴（60℃）中放置1 h；⑤置沸水浴中放置1 h；再分别加流动相稀释定容至10 ml，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液进样分析。

采用经验证的有关物质测定方法，对日本原研产品和国内上市同品种进行有关物质分析。

专属性试验结果表明，空白辅料、盐酸地芬尼多、杂质Ⅰ互不干扰，分离度符合《中国药典》（2015年版四部）[17]要求，色谱图见图1。

“2.4”项试验结果表明，盐酸地芬尼多的检出限为2.8 ng，定量限为7.0 ng；杂质Ⅰ的检出限为2.8 ng，定量限为9.7 ng。

耐用性试验结果表明，在各变动色谱条件下，主峰与杂质峰、杂质峰之间分离良好，方法的耐用性好，具体见表1。

稳定性试验结果表明，盐酸地芬尼多溶液室温下放置18 h，主峰面积及杂质峰面积的RSD均＜2%；杂质谱特征一致，溶液稳定性良好。

线性试验结果表明，杂质Ⅰ在0.4829～48.2900μg/ml范围内线性关系良好，回归方程为A=1.6526C+0.0086（R2=1）。

重复性试验结果表明，6次测定杂质Ⅰ含量RSD为4.6%（n=6），方法重复性良好。

精密度试验结果表明，12次测定杂质Ⅰ含量RSD为4.2%（n=12），精密度良好。

回收率试验结果表明，平均回收率为102.6%，符合要求，具体见表2。

强制降解对比试验结果表明，空白辅料性质稳定，在强制降解条件下不影响盐酸地芬尼多的稳定性；盐酸地芬尼多仿制片和原研片在光照、氧化、热及碱破坏条件下有关物质均无显著变化，在酸破坏条件下主峰降解明显，降解15%，杂质Ⅰ增加15%，基本实现物料平衡，主峰纯度符合要求。仿制片和原研片在强制降解试验中杂质降解行为一致。对比图谱具体见图2～6。

有关物质测定结果表明，湖南千金湘江药业有限公司仿制片与原研片有关物质一致，检出的已知杂质Ⅰ含量与原研片检出的含量相当。广西大海阳光药业有限公司有一批次检出未知杂质，且含量＞0.2%，其他企业各批次检出的杂质Ⅰ含量偏高，但总体结果均符合《中国药典》[1]规定限度（杂质Ⅰ不得超过1.0%，其他各杂质总和不得超过1.0%），具体见表3。

本研究对国内市场上首仿企业的仿制片（市场占有率近70%）及其他三家国内企业的同规格制剂与原研片进行了有关物质对比分析。选用的方法为《中国药典》[1]收载的高效液相色谱法。《日本药典》17版[19]和《韩国药典》第10版[20]收载的盐酸地芬尼多质量标准，其中检测有关物质的方法为薄层色谱法，通过比较供试品出现的除主峰外其他的斑点不得深于标准斑点，来判断有关物质是否符合标准，此法不能准确定量杂质Ⅰ的含量，且难以检出其他微量杂质，使用了有毒试剂甲苯，灵敏度低。高效液相色谱法可准确定量杂质Ⅰ含量，灵敏度高，且能检出其他杂质，所以最后选定此法开展实验。

原研片中的有关物质，三批仅其中一批检出了杂质Ⅰ，且含量＜0.2%，其他两批未检出任何杂质。湖南千金湘江药业有限公司仿制片有关物质与原研片基本一致。且结合两者的强制降解对比试验结果，首仿片和原研片杂质降解行为一致。因此可判断首仿制剂有关物质质量与原研片一致。考察的其他三家企业仿制片杂质Ⅰ含量高出原研片的2～5倍，且其中一批检出了未知杂质，含量超过0.2%。课题组还对该制剂的体外溶出进行了相关研究[3]，结合有关物质分析结果，国内该制剂的生产厂家还需改进制剂处方工艺，以使其达到与原研片内在质量一致。

现行的《中国药典》[1]规定该片剂中杂质Ⅰ不得超过1.0%，其他各杂质总和不得超过1.0%，根据样品测定结果建议把杂质Ⅰ的限度修订为不得超过0.5%，促使企业提高该制剂的质量水平。

本研究采用的测定方法专属性强，灵敏度高，线性、精密度、稳定性、准确度均良好；国内首仿厂家与原研厂家片剂有关物质一致，且在强制降解试验中杂质降解行为一致；另三家企业片剂的已知杂质Ⅰ含量较原研厂家偏高2～5倍。

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Analysis of related substances in Difenidol Hydrochloride Tablets

CHEN Min-min TANG Xiao-peng WU Ze-jun LIU Shui-ping▲ WANG Xi
Zhuzhou Institute for Food and Drug Control,Hu′nan Province,Zhuzhou 412000,China

[Abstract]Objective To evaluate the consistency of related substances between the domestically marketed Difenidol Hydrochloride Tablets and reference preparations.Methods The related substances of Difenidol Hydrochloride Tablets were determined and evaluated according to the official quality standard recorded in Pharmacopoeia of the People′s Republic(2015 edition,version 2).The forced degradation test was also carried out.Results The detection limit of impurityⅠwas 2.8 ng,and the quantitative limit was 9.7 ng.The solution of Difenidol Hydrochloride was stable in 18 hours,and the relative standard deviation (RSD)of impurities and main peak area was less than 2%.The linearity range of impurityⅠwas 0.4829-48.2900μg/ml(R2=1).In the precision test of impurityⅠ,the RSD of peak area was 4.2%(n=12).The average recovery of impurityⅠ(n=6)was 102.6%,and RSD was 2.0%.No impurities were detected in two batch tablets of the first domestic manufacturer.The content of impuritiesⅠwas 0.14%in another batch.No impurities were detected in two batch tablets of the original manufacturer.The content of impuritiesⅠwas 0.10%in another batch.The content of impuritiesⅠwas among 0.2%-0.5%in the other three domestic manufacturers′tablets.Under the conditions of light,oxidation,heat and alkaline damage,there was no significant change in the related substances between the first domestic imitator and the original manufacturer′s tablets.Under the acid damage condition,the degradation of the main peak was 15%,and the increase of impurityⅠwas 15%.Conclusion Impurity profiling of the first generic preparations is consistent with the reference preparations.For other three domestic manufacturers,impurityⅠcontent is 2-5 times higher than that of the reference preparations.

[Key words]Difenidol Hydrochloride Tablets;Related substances;High performance liqiud chromatography;Difenidol Hydrochloride

[基金项目]湖南省食品药品监督管理局食品药品安全科技项目（湘食药科R201618）

[作者简介]陈珉珉（1985-），女，汉族，湖南株洲人，硕士，工程师，主要从事食品药品安全检测与研究

▲通讯作者：刘水平（1977-），女，汉族，湖南安化人，本科，主任药师，主要从事食品药品安全检测与研究

（收稿日期：2020-01-21）