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癫痫是常见的神经系统疾病，严重影响患者的生活质量，其中局灶脑皮质发育不良（FCD）是难治性癫痫的重要原因之一，其确切的发病机制仍不清楚，内科治疗及外科手术仍难以控制癫痫发作[1-2]。有学者认为，癫痫是由大脑皮层神经网络兴奋性和抑制性因素之间的不平衡引起的过度兴奋现象，再加上大量神经元群体中的强烈同步放电所引起[3]，γ-氨基丁酸（GABA）是重要的中枢抑制性递质，分布于神经轴突和小神经元，GABA由谷氨酰胺通过谷氨酸脱羧酶（GAD）的催化下合成，GAD是GABA的限速酶，GAD存在GAD65和GAD67两种同工酶[4]。目前有研究表明GABA与癫痫、焦虑症、精神分裂症、僵硬综合症等疾病相关[5-6]。本研究拟通过FCD癫痫患者病灶处GAD-65/67的表达分布情况探讨FCD相关性癫痫的发病机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集广州医科大学附属脑科医院神经外科和广州医科大学附属第二医院癫痫中心2017年10月～2019年10月收治的FCD相关难治性癫痫患者手术中切除的病灶，运用磁共振、PET/CT、视频脑电图等进行术前评估和定位，术中脑电图定位切除病灶，术后病理诊断参考国际抗癫痫联盟的FCD诊断标准[7]，共纳入FCD患者23例为实验组，其中ⅠA型4例，ⅠB型5例，ⅡA型6例，ⅡB型8例；女10例，男13例；年龄2～35岁，平均（11.6±4.6）岁。对照组7例，为无癫痫相关病史的正常脑皮层组织，为术中大脑皮层造瘘获取，女3例，男4例，年龄5～68岁，中位年龄35岁。

1.2 实验方法

所有实验组和对照组病例手术切除病灶立即放入4%组织固定液（Solarbio Technology Co.，Ltd，批号P1110）中浸泡，常温下放置24 h，流水冲洗，石蜡包埋收集标本。实验时每个标本用切片机连续切片3～4张，切片厚度5μm表在载玻片上；行苏木精-伊红（HE；Solarbio Technology Co.，Ltd，批号G1120）染色及GAD65/67免疫组化染色，免疫组化实验步骤如下：二甲苯浸泡切片5 min 3次，梯度酒精水化，pH值为6.0的柠檬酸煮沸15 min修复抗原，室温冷却；用SP试剂盒（福州迈新公司，批号KIT-9720）进行免疫染色，0.3%过氧化氢封闭血清抗原，4℃孵化过夜，切片再用兔anti-GAD65/67孵化（ThermoFisher，规格1∶100；编号PA1-84572）室温30 min，磷酸盐缓冲液（PBS，武汉Boster公司，编号Boster AR0030）冲洗，最后用二氨基联苯胺（DAB）试剂盒（福州迈新公司、编号DAB0031）免疫组化显色2 min，复染用mayer氏液（Solarbio Technology Co.，Ltd，编号G1080）染色5 min，流水冲洗固蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每张免疫组化玻片在电子显微镜（日本，Nikon，型号：80i）下进行拍照，选取不同位置脑皮层拍照3张，放大200倍，定性观察GAD-65/67在实验组与对照组脑皮层的表达分布差异，再运用Image-Pro Plus7.0计算光密度值，定量分析实验组与对照组的差别。

1.3 统计学方法

运用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析，非正态分布的连续型变量采用中位数（四分位数）表达，组间比较采用Mann-Whitney U检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色结果

对照组大脑皮层神经元层可见清晰的6层分布（图1A，A’），皮层与皮层下分界明显，皮层下无神经元分布。实验组病例皮层均不能清晰辨认出6层分布，FCDⅠA型神经元形态无明显异常，神经元排列紊乱，无规律6层结构（图1B，B’）；FCDⅠB型见神经元排列紊乱并减少，神经纤维排列走形方向紊乱（图1C，C’）；FCDⅡA型以巨大神经元为特点，皮层可见大量核大、形态异常的巨大神经元，皮层下可见巨大神经元（图1D，D’）；FCDⅡB型可见典型巨大神经元、气球样细胞（图1E，E’）。

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图1 两组大脑皮层病理组织学对照图（HE染色，200×）

A图中Ⅰ～Ⅵ代表正常大脑皮质的皮质分子层、外颗粒层、外锥体细胞层、内颗粒层、内锥体细胞层和多形细胞层；A～E图中的方框分别对应右侧A’～E’图；E’图中有尾箭头指示巨大神经元，无尾箭头指示气球样细胞；A～E比例尺为1∶200μm，A’～E’比例尺为1∶500μm

2.2 免疫组化染色结果

对照组整体皮质从第Ⅰ～Ⅵ层可见GAD-65/67阳性染色均匀分布，中间小神经元可见GAD-65/67浓染，且集中在Ⅲ、Ⅳ层，椎体细胞胞体未见明显阳性染色，椎体细胞周围可见分稍浓染的轴突分布（图2F，F’）。实验组病例均可见GAD-65/67阳性染色，染色部位发生变化。在FCDⅠA型（图2G，G’）和FCDⅠB型（图2H，H’）脑皮层的表达分布，神经纤维可见明显表达，较对照组稍浓染，中间小神经元浓染，小神经元排列分布紊乱，可见散在整个脑皮层及部分皮层下，椎体细胞周围可见均匀分布，染色不如神经纤维明显。在FCDⅡA型（图2I，I’）和FCDⅡB型（图2J，J’）脑皮层的表达分布，神经纤维可见染色，中间小神经元浓染，小神经元排列分布紊乱，巨大异形神经元胞体未见表达分布，其周围突触明显较正常对照组和FCDⅠ型神经元周围突触浓染。

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图2 两组GAD-65/67免疫组化图（200×）

F～J图中的方框分别对应右侧F’～J’图；J’图中有尾箭头指示巨大神经元，无尾箭头指示气球样细胞；F～J比例尺1∶300μm，F’～J’比例尺1∶800μm

2.3 两组脑组织GAD-65/67光密度值的比较

对照组的脑组织GAD-65/67光密度值[215.6（195.8，237.8）]与实验组[199.5（141.2，242.0）]比较，差异无统计学意义（U=1.392，P=0.167）。

3 讨论

1971年由Taylor等[8]学者首次报道了FCD，目前在病理、影像学、遗传基因学及分子生物学、抗癫痫药物耐药机制、外科手术治疗等多方面展开大量研究，FCD如何导致癫痫发作的确切病因和发病机制尚了解不多，本文仅从分子机制及病理学角度进行相关发病机制的探讨。

一般认为，FCD相关癫痫，是由于皮层神经网络兴奋性和抑制性功能的失衡所致。神经网络中兴奋性成分和抑制性成分组成复杂，任何一个环节出现问题均会对神经网络的稳态造成影响。神经网络主要由兴奋性谷氨酸能神经元和抑制性GABA能神经元组成；先前学者对GABA与癫痫做了大量研究，GABAAγ2亚基功能缺失与儿童失神发作、高热惊厥密切相关[5]，GABA-B受体拮抗剂已被证明具有阻止几种急性和慢性失神发作的作用[9]。多项研究表明，改变GABAAR亚基的表达与癫痫发生有关[10-11]。动物实验表明[12]，GABA能神经元数量的减少和功能的降低以及GABA受体功能的改变都能引起神经网络过度兴奋，扰乱GABA神经元的正常发育，使皮层中GABA神经元减少，从而导致癫痫发作。FCD相关癫痫的突触抑制功能障碍的研究表明，在FCD组织中转运蛋白介导的GABA再摄取功能减低及突触后电位频率减低，这可能与癫痫发作直接相关[13]。

在哺乳动物的大脑中主要抑制性神经递质GABA的生物合成取决于GAD，该酶存在两种同工型，即GAD-65和GAD-67，由不同的基因编码形成，GAD-65主要表达分布在GABA能突触中，GAD-67分布在囊泡及小细胞神经元[14-15]。有研究表明[16]，小鼠敲除编码GAD-65的基因，小鼠大脑GABA含量降低20%～30%，而大脑谷氨酸含量没有变化，这可能与这些小鼠的惊厥前状态及癫痫发作相关，且容易诱发自发性癫痫的发作，死亡率增加。

参考先前学者研究，有不少学者探索人FCD组织中GAD的表达，结果不完全相同，法国学者研究认为，GAD-65和GAD-67在癫痫病灶皮层及海马组织中GABA神经元中的基因和蛋白质水平上调[17]。Medici等[18]对癫痫患者手术切除FCD组织进行研究，观察到在FCDⅠ型和Ⅲ型中证明了选择性GAD-65/67表达受损，在FCDⅡ型中确认了分布异常但未减少；Garbelli等[19]对26例FCDⅠA型进行分析，发现GAD-65/67表达明显减少。本研究中所有脑皮层均有GAD-65/67表达分布，因病例数量有限且实验组FCD病理分类不齐全，本研究未细分FCD病理进行统计。本研究对免疫组化载玻片进行光密度分析统计，结果显示实验组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），但从免疫组化细胞结构观察GAD-65/67在皮层分布，正常脑皮层分布较为均匀，围绕皮层椎体细胞周围可见均密集分布，可能为GAD-65在神经突触内的表达，GAD-65中间神经元分布较密集分布，中间神经元集中分布在脑皮层3～4层，与Medici等[18]观察的结果相似，FCD组织中GAD-65/67表达分布发生明显改变，在巨大、异性神经元周围突触较正常脑皮层明显增强，中间神经元分布无规律，皮层下可见分布；本研究认为，GAD-65/67在FCD患者脑皮层分布异常可能是其癫痫发作的重要机制，分布异常可导致抑制性功能减低。有试验对人FCD病灶切除后进行细胞电位测定，发现GABAA受体介导的突触后电位频率减低[20]，及GABAB受体介导的突触前电位异常，导致癫痫的发作[21]。也有学者认为，FCD相关癫痫与神经元发育异常导致KCC2、NKCl等转运蛋白导致椎体细胞内外K+分布异常，而导致椎体细胞去极化引发癫痫发作[22]。

本研究认为，FCD患者癫痫发作，不可单纯认为抑制性神经递质减少或神经元兴奋性增加所导致。大脑皮层的发生起源于邻近侧脑室生发基质中的成神经细胞，正常成神经细胞的迁移在胚胎时期7～16周完成，分批分期产生并迁移至皮层，有序排列形成皮层椎体细胞的6层结构，在迁移过程出现任何遗传因素或周围环境的有害因素，都可能导致脑皮层发育不良[23]。

本研究的病理可见典型病理改变，出现神经元迁移异常，导致神经元事情正常皮层的规律分布，同上出现了发育异常神经，神经元大小不一，以及气球样细胞出现，与国际抗癫痫组织ILAE的诊断标准相符合[7]。

本研究结果提示，FCD组织中脑皮层神经元分布紊乱，神经元形态异常，抑制性神经递质GAD-65/67分布异常，这些综合因素导致FCD脑皮层兴奋、抑制失衡，患者出现难治性癫痫及抗癫痫药物耐药。随着科技的进步，磁共振及PET/CT的普及和更新换代，有助于FCD病灶的诊断，外科手术切除病灶，可为患者提供有效快速治疗[24]。目前有较多学者从FCD的基因学研究相关发病机制，但由于脑皮层发育在胎儿时期已完成，可能无法干预FCD形成过程，手术治疗仍是较为有效的治疗方式。

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