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产后坐月膏是由黄芪、白芍、当归、熟地黄、益母草等中药材组成的中药复方制剂，具有补气养血、祛瘀生新、益肾填精的功效，适用于产后气血俱损，多虚、多瘀、多虑导致的肢体困倦，面色无华，腰膝酸痛，四肢冰冷，恶露不尽及产后抑郁等证属肾精不足、气血两虚的人群。白芍的临床应用十分广泛[1]，主要功效为平肝止痛、养血调经、敛阴止汗，用于治疗头痛眩晕、腹痛、胁痛[2]。白芍在膏方中列为臣药，芍药苷是白芍的主要成分[3]，也是白芍的特征成分[4]，成分清楚，芍药苷的含量较高[5-6]，采用高效液相色谱法测定芍药苷的含量[7-8]，结果准确、重现性好[9-10]。故本研究参照《中国药典》2015版一部药材白芍项下的含量测定方法[11]，采用高效液相色谱法[12]测定产后坐月膏中白芍主成分芍药苷的含量，旨在更好地控制药品的内在质量，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪、SPD-M20A检测器（日本岛津）；2405型紫外分光光度计（日本岛津）；KQ-300DE型超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司，功率300 W，频率40 kHz）；CPA324S型、CP225D型电子天平（赛多利斯）。

1.2 试药

对照品购买于中国药品生物制品检定所：芍药苷对照品（批号：110736-201943）；样品3批（50 g/瓶，批号：20190310、20190420、20190508）及阴性对照，均为广东省佛山市禅城区中心医院国医国药馆出品；乙腈（色谱纯，美国默克公司）；水（超纯水，实验室自制）。其他试剂均为分析纯。

1.3 C18色谱柱

VenusilMPC18 色谱柱（250mm×4.6mm，5μm，100A），Diamonsil C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

2 方法及结果

2.1 色谱条件色谱柱：Venusil MP C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，100A）或Diamonsil C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（14∶86）；检测波长：230 nm；流速：1.0 ml/min；进样量：10 μl。理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品约10 mg，置500 ml量瓶中，加稀乙醇适量溶解，加稀乙醇至刻度，摇匀，得20 μg/ml 的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备精密称取样品约1.0 g，置250 ml量瓶中，加稀乙醇适量，超声处理30 min（功率300 W，频率40 kHz），放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的制备精密称取缺少白芍的阴性对照1.0 g，同“2.2.2”项下方法制备，即可得阴性对照溶液。

图1 芍药苷对照品溶液色谱图

2.3 专属性考察

分别精密吸取“2.2.1”项的对照品溶液、“2.2.2”项的供试品溶液、“2.2.3”项的缺白芍阴性对照溶液及空白溶剂，按“2.1”项的色谱条件进样，记录色谱图，分别见图1～4。结果显示，阴性对照溶液色谱图在芍药苷对照品相应保留时间（19.290 min处）无吸收峰（图3），表明处方中其他成分无干扰，专属性好。

2.4 线性范围考察

精密称取芍药苷对照品19.30 mg，加稀乙醇溶解并稀释10 ml，摇匀作为芍药苷对照品储备液（1.93 mg/ml），分别精密吸取对照品储备液1、5、10、15、20 μl（1.93、9.65、19.30、28.95、38.60 μg/μl），测定峰面积。以芍药苷浓度（μg/μl）为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y），制作标准曲线，得到回归方程为：Y=0.0138X-0.8569（r=0.9999），结果表明，芍药苷浓度在1.93～38.60 μg/μl 的范围内，与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度考察

图2 产后坐月膏供试品溶液色谱图

图3 缺白芍阴性对照溶液色谱图

图4 空白溶剂色谱图

2.5.1 重复性试验精密称取样品（批号：20190310）6份，各约1.0 g，按“2.2.2”项下的供试品溶液制备方法制备溶液，按照“2.1”项的色谱条件进行测定，测得平均含量为5.64 mg/g，RSD=0.98%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.5.2 中间精密度考察由广东省佛山市禅城区中心医院“低温提取浓缩系统制备中药膏方的工艺及其稳定性研究”课题组3个人，分别取样品（批号：20190310）约1.0 g，按“2.2.2”项下的方法“置250 ml量瓶中”起同法制备供试品溶液，按照“2.1”项的色谱条件进行测定，结果显示，平均含量为5.59 mg/ml，RSD=1.02%，表明该方法重现性好。

2.6 稳定性考察取相同的“2.2.2”项下的供试品溶液，分别于24 h 内每隔3 h，按“2.1”项的色谱条件进行测定，记录峰面积，测定结果显示，峰面积无明显的变化，RSD=0.52%（n=8），表明样品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 加样回收率考察

精密量取样品（批号：20190310）9份，各约1.0 g，分成高、中、低3组，精密加入芍药苷对照品溶液（0.263 mg/ml）各5.0、10.0、15.0 ml，再按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按照“2.1”项的色谱条件进行测定。加样回收数据结果见表1。结果显示，平均回收率为99.96%，RSD=0.81。

表1 加样回收率考察

2.8 方法耐用性考察

2.8.1 检测波长的确定取芍药苷对照品溶液（20 μg/ml）于200～400 nm 波长进行紫外扫描，结果表明，最大吸收波长为229.60 nm，故确定方法的测定波长为230.0 nm。

2.8.2 提取时间的考察分别精密称取样品（批号：2019 0310）4份，各约1.0 g，加稀乙醇适量，分别用20、30、40 min 及1 h 超声提取，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按照“2.1”项的色谱条件进行测定。结果显示，芍药苷含量分别为：5.51、5.62、5.69、5.66 mg/g，表明稀乙醇不同提取时间的芍药苷含量基本一致，考虑实验效率和充分溶解，确定以中位值（超声提取30 min）为拟定方法。

2.8.3 色谱柱考察分别使用不同品牌的色谱柱，Venusil MP C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，100A），Diamonsil C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）进行检测，结果显示其各项色谱指标等均达到液相色谱测定法的要求。

2.9 样品的测定

分别取3个批号的样品，按“2.1”项的色谱条件进行芍药苷的含量测定，测定结果分别为：5.64 mg/g（20190310）、5.02 mg/g（20190420）、5.31 mg/g（20190508）。

3 讨论

本研究中，提取溶剂曾分别考察乙醇、稀乙醇、1%盐酸稀乙醇，同法测定含量，结果稀乙醇的溶出量最大，拟定提取溶剂为稀乙醇[13-14]。流动相曾考察了乙晴-0.1%磷酸溶液（14∶86）、乙腈-水（14∶86）两个流动相系统，结果显示在乙腈-水（14∶86）系统中，样品分离度符合要求，故拟定流动相系统选择乙腈-水（14∶86）[15-16]。流速曾考察了0.5、1.0 ml/min，以1.0 ml/min流速分离度好，故选择流速为1.0 ml/min[17-18]。

高效液相色谱法法测定产后坐月膏中芍药苷的含量，方法简单、准确，能有效控制产品的内在质量。

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