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食管癌作为国内外常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类的生命健康，每年全世界新增的病例数约40万，新增病例在所有的消化道恶性肿瘤中处于第三位，居世界肿瘤发病率的第六位，恶性肿瘤死亡率的第七位[1-2]。国内外，在高发病率和高致死率的常见肿瘤中，食管肿瘤占据着一席之地，每年新增的食管癌病例中，我国占一半以上，其中，以食管鳞癌为主。我国人口众多，加上食管癌的高发病率及致死率，导致我国的食管癌患者数目不容小觑，因此，对于食管癌的发病机制及治疗手段的研究已经引起了重视。迄今为止，对于食管癌的治疗手段主要以手术治疗、放射治疗及化疗治疗为主，尽管各种靶向治疗、免疫治疗、细胞治疗药物不断研发并予以应用，食管癌的治疗手段日益丰富，抗肿瘤效果日益显效，但是对于肿瘤的发病机制并未完全阐明，肿瘤复发转移等众多难题依然没有解决，仍需要更深入全面研宄。近年来，随着临床医学研究的不断完善，与肿瘤发病和进展有关的基本过程也逐渐被阐明，基于相关研究所研发的各种新型的抗肿瘤药物组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）也被广泛地应用于临床中[3]。丙戊酸（VPA）作为HDACi 可以影响患者的肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的增殖，从而诱导肿瘤细胞凋亡，在临床应用方面具有非常高的价值。HDACi 在血液/淋巴系统肿瘤的治疗方面已经有了一定的成果，但是对于在食管癌的治疗方面，HDACi 在这一领域还处于初步阶段，其在食管癌治疗方面仍然需要加大力度，深入研究[4]。本研究旨在探讨VPA 对食管癌细胞增值凋亡的影响及其抗肿瘤活性机制的研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料与主要仪器

1.1.1 实验材料 ECa-109 细胞株，购自中科院上海细胞库。

1.1.2 药物与试剂 VPA（四川科瑞制药股份有限公司，批号：2014B00672）；RPMI1640 培养液、胰酶为Invitrogen 公司产品；优级胎牛血清（BSA）为杭州四季青公司产品；二甲基亚砜（DMSO）、结晶紫、甲基偶氮唑盐（MTT）为Sigma 公司产品；细胞周期试剂盒、Annexin V-PI 细胞凋亡试剂盒为江苏凯基生物技术有限公司产品；CyclinD1 蛋白、p21 抗体、HDAC3、HDAC4 为英国Abcam 公司产品；Bcl-2、Bcl-w、Bcl-XL、Mcl-1 抗体、Survivin 抗体、Caspase3、8、9、10 抗体为美国Cell Sinaling Technology 公司产品；FITC 标记山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗体IgG（H+L）为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。

1.1.3 主要仪器细胞培养箱为Thermo 公司产品；超净工作台为HEALFORCE 公司产品；酶联免疫检测仪、倒置相差显微镜、流式细胞仪、紫外分光光度计为Olympus 公司产品；酶标仪器、水浴箱为美国Thermo Fisher 公司产品；SDS-PAGE 电泳仪为北京君意东方电泳仪器有限公司产品；蛋白检测转膜装置为Bio-Rad 公司产品；离心机为湖南湘仪公司产品；超低温冰箱海尔公司产品；移液器、培养板6、12、96 孔为Corning 公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养将装有ECa-109 细胞的冻存管从液氮中取出，迅速置于37℃水浴箱中解冻，细胞超净台上将细胞移至5 ml 离心管，1000 r/min 离心5 min，迅速除去上清液，加入新鲜的培养液，将细胞反复吹打均匀，然后置于5% CO2 的培养箱中培养，温度设置为37℃。观察细胞的生长情况，24 或48 h 更换新鲜的培养液，等到细胞长满培养瓶底面约80%时进行细胞的传代。用干净的BSA 重新洗涤细胞，胰酶消化，待大部分的细胞从培养瓶底面上脱落下来后，继续加入新鲜的培养液停止消化，用移液器将处理好的细胞悬液移入干净的离心管中，离心后将上清液洗净，将离心、洗净后的细胞加入新鲜的培养液，根据上述的步骤重新制成细胞悬液并使其均匀分布瓶底，然后将其分装为3 瓶，加入新鲜的培养液后放入培养箱中继续培养，以备待用。

1.2.2 MTT 测定细胞抑制率在96 孔板接种ECa-109细胞，分别加入0.00 （空白对照）、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L 的VPA 处理细胞24、48、72 h，每个浓度设3 个复孔，处理过程中观察不同浓度处理细胞的形态变化与生长情况。随后加入适量浓度为5 mg/L 的MTT溶液，将不同处理浓度的ECa-109 细胞放入培养箱中持续培养一定的时间；当细胞培养完成后，将孔内旧的培养液弃去，然后用标记好的移液器向每孔加入适当的无菌DMSO，在室温条件下孵育半小时后缓慢震荡10 min，上机，设定波长490 nm，设置调零孔，对每孔的吸光度值进行检测比对，得出不同处理浓度ECa-109 细胞的吸光度平均值，根据公式“抑制率（E）=1-实验组平均吸值/对照组吸光度值”计算抑制率，用上述的实验方法重复3 次，做出抑制率曲线。

1.2.3 细胞周期检测在6 孔板接种ECa-109 细胞，24 h后加入浓度为0.5 mmol/L 的VPA 处理细胞0、24、48 h。收集不同处理时间的ECa-109 细胞，用干净的70%乙醇固定，按照细胞周期试剂盒操作说明书，处理收集到的ECa-109 细胞，室温避光处理半小时，然后用流式细胞仪对其进行检测。收集到的数据经由仪器软件处理和分析。

1.2.4 细胞凋亡检测按上述的方法接种和处理ECa-109 细胞，然后根据Annexin V-PI 细胞凋亡试剂盒操作说明书，处理收集到的ECa-109 细胞，室温避光反应15 min，接着用流式细胞仪对其进行检测。收集到的数据经由仪器软件处理和分析。

1.2.5 Western Blot 检测 VPA 可促进食管癌细胞凋亡来抑制食管癌细胞的生长。为了进一步探究VPA诱导的食管癌细胞凋亡的潜在的分子机制，选用Western Blot 检测CyclinD1、p21、Survivin、Bcl-2 家族和Caspase 蛋白、C-PARP 及PI3K/Akt 和MAPK 信号因子；在浓度为0.5 mmol/L VPA 处理0、24、48 h 后，经过RIPA 裂解、蛋白的提取、蛋白溶度的测定、蛋白电泳、转膜、封闭后进行抗体孵育及显影。加入配置好的一抗室温下孵育2 h，TBST 洗涤干净后，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育1 h，然后将多余的抗体弃去，加入显影液使其覆盖膜表面，最后进行显影。

1.3 统计学方法

采用SPSS 15.0 统计软件进行统计学处理，实时定量RT-PCR 实验重复3 次，每次做3 个重复孔，计量资料用均数±标准差（

±s）表示，比较采用t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT 检测不同VPA 浓度处理对细胞生长的抑制作用

VPA 能够抑制ECa-109 细胞活力，且抑制作用具有浓度依赖性，随着浓度的增高，抑制效果明显增强，而且其IC50 值为0.5 mmol/L，此浓度将作为后续试验VPA 的浓度；进一步分析得出，相同时间及浓度下，药物作用时间越长，抑制率越高，生存能力越低。不同浓度VPA 两两比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。VPA 对细胞的增殖抑制作用随其浓度的增加而增强，用浓度为0.5 mmol/L 的VPA 分别作用于细胞24、48、72 h 后，发现其对细胞生长均有明显的抑制作用，抑制率分别为（31.20±0.21）、（54.30±0.23）、（57.40±0.33）%，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。不同时间下VPA 对细胞的抑制率有显著影响（P＜0.05）（图1）。

图1 不同VPA 浓度处理对细胞生长的抑制作用

2.2 流式细胞检测细胞凋亡及周期的变化

经VPA 处理后的食管癌细胞，处于G2/M 期的细胞随着浓度的增加而逐渐增多；VPA 对食管癌细胞诱发凋亡有作用，0.5 mmol/L VPA 在0、24 和48 h 时，细胞凋亡比例依次为2.6%、11.9%、17.4%，食管癌凋亡细胞的数目随着药物作用时间的延长，细胞凋亡的数目逐渐增多（图2）。

图2 ECa-109 细胞诱导凋亡的情况

2.3 VPA 对CyclinD1 蛋白和p21 调控蛋白表达的影响

经0.5 mmol/L VPA 处理后的食管癌细胞，CyclinD1蛋白表达水平降低，而p21 表达水平增高，而且随着药物作用时间的延长，具有一定的时效关系（图3～4）。

图3 ECa-109 细胞CyclinD1 蛋白的表达情况

图4 ECa-109 细胞p21 蛋白的表达情况

2.4 VPA 对Caspase 家族蛋白表达的影响

经过0.5 mmol/L VPA 处理后的食管癌细胞对Caspase 家族蛋白的影响主要是通过调节相应的活化蛋白C-Caspase-3、C-Caspase-8、C-PARP 的表达水平，且随着药物作用时间的延长，增加了相应的活化蛋白C-Caspase-3、C-Caspase-8、C-PARP 的表达水平（图5～7）。

图5 ECa-109 细胞C-Caspase-3 蛋白的表达情况

图6 ECa-109 细胞C-Caspase-8 蛋白的表达情况

图7 ECa-109 细胞C-PARP 蛋白的表达情况

2.5 VPA 对Bcl-2 家族蛋白和Survivin 蛋白表达的影响

经过0.5 mmol/L VPA 处理后的食管癌细胞，降低了Bcl-2 家族蛋白和Survivin 蛋白的表达，且随着作用时间的延长，Survivin 蛋白的表达以及抗凋亡蛋白Mcl-l、Bcl-XL 的表达逐渐降低（图8～10）。

图8 ECa-109 细胞Survivin 蛋白的表达情况

图9 ECa-109 细胞Mcl-1 蛋白表达的情况

图10 ECa-109 细胞Bcl-XL 蛋白的表达情况

2.6 VPA 对PI3K/AKT 和MAPK 信号通路的影响

经0.5 mmol/L VPA 处理食管癌细胞后，Akt 和MAPK 信号因子表达水平降低，且随着作用时间的延长，Akt、MAPK 的表达逐渐下降（图11～12）。

图11 ECa-109 细胞Akt 蛋白的表达情况

图12 ECa-109 细胞MAPK 蛋白的表达情况

3 讨论

随着临床医学研究工作的逐渐深入，越来越多的研究发现在肿瘤的发生与发展中，除了基因突变外，表观遗传调控也扮演者重要的角色[5-6]。在众多的表观遗传调控中都存在着相对应的一系列酶对其进行修饰，而在这些表观遗传调控修饰酶中，HDACS 作为其中的一类存在意义重大，其参与了许多生物化学信号传导通路的去乙酰化修饰，其作用与有效干扰肿瘤发生、发展的信号传导激活密切相关，这为在临床展开研究工作和治疗肿瘤提供了新的切入点。目前，所有HDACi 按照化学结构可分为4 大类：以MGCD0103、MS-275 等为代表的苯酰胺类；以TSA、PXD-101、SAHA 等为代表的异羟肟酸类；以丁酸钠、丙戊酸等为代表的羧酸类；以Trapoxin、Aci- dipin、FK-228 等为代表的环肽类。由于HDACi 的抗肿瘤分子机制相对的复杂，再加上不同肿瘤类型中其抗肿瘤机制有着非常大的差别，对于各个HDACi 在体内的抗肿瘤机制依然存在欠缺[7-10]。目前已有多种HDACi 被批准上市，主要用于血液/淋巴系统的治疗，包括伏立诺他、罗米地辛、贝林司他、西达本胺等[4，11]。但是，由于药代动力学性质以及肿瘤特异性等原因，大多数HDACi在实体瘤治疗中的效果并不令人满意。

根据目前相关研究显示，VPA 具有明显的HDACi活性，可以特异性地作用在HDACⅠ与HDACⅡ中，故具有抗肿瘤作用的效果[12]。本次研究所使用的VPA归于短链脂肪酸（SCFA）的范畴内。其优势在于患者耐受性较好且不会产生明显的副作用。本研究结果显示，VPA 可影响ECa-109 细胞的增殖凋亡以及抑制细胞的生长，而且具有浓度依赖性，尤其在浓度为0.05 mmol/L 时即可明显抑制食管癌细胞的活力和增殖。能够通过抑制CyclinD1 启动子组蛋白H4 的乙酰化水平，诱导细胞G2/M 期阻滞和细胞凋亡，显示出较强的抗食管癌活性。相关研究表明，在大多数的肿瘤模型当中，HDACi 已经被证实可以通过影响细胞内、外信号转导途径而发挥作用[13]。死亡受体（DR）转导通路在大多数的转导途径中有与其相对应的配体，当死亡受体和其相对应的配体结合后就能够启动凋亡途径，诱导相对应的细胞凋亡。相关的研究已经证实，在乳腺癌中，MS275 和SAHA 能够诱导TRAIL 的表达而不改变DR4 和DR5 水平，通过募集FADD 和激活Caspase8 促进肿瘤细胞的调亡[14]。另有研究表明，线粒体凋亡途径也被证实能够通过细胞内外信号转导途径而发挥作用，其受到外界应激因素的干扰破坏线粒体内蛋白质的释放，导致Caspase8、Caspase9的释放和活化，紧接着被活化的Caspase3、Caspase6、Caspase8 和已被激活的Caspase8 和Caspase9 共同作用诱导细胞的调亡[14]。在调节细胞凋亡的过程中，细胞内的促调亡蛋白和抗调亡蛋白也发挥着非常重要的作用[15]。本研究结果显示，VPA 能够通过对Caspase通路的干扰及减少Survivin 蛋白的表达，下调Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白Bcl-XL、Mcl-1 等机制促进细胞的凋亡来影响食管癌细胞。相关研究表明，细胞周期抑制剂p21 可以被HDACi 特异性地抑制[16-17]；而且，抑制HDACS 可以阻断多种肿瘤生长相关信号通路，如PI3K/Akt、MAPK/Erk 等[18-19]。因此，本研究通过Western Blot 检测了VPA 对p21 表达和PI3K/Akt、MAPK/Erk 这两条细胞生长依赖的生存信号通路的影响，结果显示，VPA 可明显上调细胞周期抑制剂p21的表达水平以及抑制这两条信号通路中的关键蛋白Akt、MAPK 的磷酸化，提示VPA 抗食管癌活性不仅仅涉及简单的分子机制，还可以通过上调p21、抑制PI3K/Akt 和MAPK 信号通路在其中发挥重要作用。经0.5 mmol/L VPA 处理食管癌细胞后，Akt 和MAPK信号因子表达水平降低，且随着作用时间的延长，Akt、MAPK 的表达逐渐降低。出现这一结果的原因为VPA 作用癌细胞后，抑制了AKt 及MAPK 的激活，使其表达降低，间接影响其下游靶基因的激活，从而调节下游凋亡相关蛋白Caspase 表达。

综上所述，本研究报道的一种高活性的HDACi——VPA 的抗食管癌作用及其分子机制，VPA 可以影响食管癌细胞的增殖凋亡，且具有浓度依赖性；可以通过降低CyclinD1 启动子组蛋白H4 的乙酰化水平，抑制G2 期CyclinD1 的转录和表达使食管癌细胞周期停滞在G2/M 期；可以通过影响蛋白酶途径和减少Survivin 蛋白的表达促进细胞凋亡，并下调Bcl-2 家族中的抗凋亡蛋白Bcl-XL 和Mcl-1，从而激活多重信号转导途径和诱导细胞凋亡；可以通过降低CyclinD1 蛋白的表达和上调细胞周期抑制剂p21 表达水平，并有效抑制Akt 和MAPK 的磷酸化，影响PI3K/Akt 和MAPK 信号通路的表达而影响食管癌细胞的生长，为进一步临床用药提供了理论依据；然而，目前有关VPA 在食管癌患者体内单独用药效果如何以及用药后不良反应的相关报道罕见，需要进一步的动物实验及临床研究，随着该领域研究工作的不断深入，HDACi VPA 在食管癌方面的应用价值必然会不断的增强。

[参考文献]

[1]郭琼.甲基化、乙酰化修饰改变对食管癌细胞生长及相关基因表达的研究[D].乌鲁木齐：新疆医科大学，2015.

[2]王小兵.MIC1 在食管鳞癌诊断和抗体靶向治疗中的意义及其作为肿瘤干细胞治疗靶点的初步研究[D].北京：北京协和医学院，2014.

[3]吴健，王晶晶，杨鲸蓉，等.组蛋白去乙酰化酶抑制剂对食管癌细胞抗肿瘤活性及其相关机制的研究进展[J].东南国防医药，2018，20（4）：394-398.

[4]Wahaib K，Beggs AE，Campbell H，et al.Panobinostat：A histone deacetylase inhibitor for the treatment of relapsed or refractory multiple myeloma[J].Am J Health Syst Pharm，2016，73（7）：441-450.

[5]Conte M，Palma RD，Altucci L.HDAC inhibitors as epigenetic regulators for cancer immunotherapy[J].Int J Biochem Cell Biol，2018，98：65-74.

[6]Carolina V D A，Julia H，César C，et al.Epigenetic priming in cancer initiation[J].Trends Cancer，2018，4（6）：408-417.

[7]Knipstein J，Gore L.Entinostat for treatment of solid tumors and hematologic malignancies[J].Expert Opin Investig Drugs，2011，20（10）：1455-1467.

[8]Ozaki T，Wu D，Sugimoto H，D，et al.Runt-related transcription factor 2 （RUNX2） inhibits p53-dependent apoptosis through the collaboration with HDAC6 in response to DNA damage[J].Cell Death Dis，2019，4（4）：e610.

[9]Lopez G，Bill KL，Bid HK，et al.HDAC8，a potential therapeutic target for the treatment of malignant peripheral nerve sheath tumors （MPNST）[J].PLoS One，2015，10（7）：e133302.

[10]Saito T，Nishida K，Furumatsu T，et al.Histone deacetylase inhibitors suppress mechanical stress-induced expression of RUNX-2 and ADAMTS-5 through the inhibition of the MAPK signaling pathway in cultured human chondrocytes[J].Osteoarthritis Cartilage，2013，21（1）：165-174.

[11]Yoon S，Eom GH.HDAC and HDAC inhibitor：from cancer to cardiovascular diseases[J].Chonnam Med J，2016，52（1）：1-11.

[12]Yang H，Maddipoti S，Quesada A，et al.Analysis of class Ⅰand Ⅱ histone deacetylase gene expression in human leukemia[J].Leuk Lymphoma，2015，56（12）：3426-3433.

[13]Glaser KB.HDAC inhibitors：Clinical update and mechanism-based potential[J].Biochem Pharmacol，2007，74（5）：659-671.

[14]Xu J，Zhou JY，Wei WZ，et al.Sp1-mediated TRAIL induction in chemosensitization[J].Cancer Res，2008，68（16）：6718-6726.

[15]Fulda S.Modulation of TRAIL-induced apoptosis by HDAC inhibitors[J].Curr Cancer Drug Targets，2008，8（2）：132-140.

[16]Zhou H，Cai Y，Liu D，et al.Pharmacological or transcriptional inhibition of both HDAC1 and 2 leads to cell cycle blockage and apoptosis via p21Waf1/Cip1 and p19INK4d upregulation in hepatocellular carcinoma[J].Cell Prolif，2018，51（3）：e12447.

[17]Arts J，King P，Marien A，et al.JNJ-26481585，a novel"second-generation" oral histone deacetylase inhibitor，shows broad-spectrum preclinical antitumoral activity[J].Clin Cancer Res，2009，15（22）：6841-6851.

[18]Witt O，Sand K，Pekrun A.Butyrate induced erythroid differentiation of human K562 cells involves inhibition of ERK and activation of p38 MAP kinase pathways[J].Blood，2000，95（7）：2391-2396.

[19]Peng Z，Guo Z，Ying W，et al.Histone deacetylase inhibitors inhibit the proliferation of gallbladder carcinoma cells by suppressing AKT/mTOR signaling[J].PLoS One，2015，10（8）：e136193.