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二至丸（Erzhiwan，EZW）是由女贞子、墨旱莲组成的我国的经典名方，出自清代《医方集解》，两者均归肝肾经，具有补益肝肾、滋阴养血的功效，常用于肝肾阴虚、腰膝酸软、头晕耳鸣等证[1-3]。现代药理研究结果显示，二至丸具有抗氧化、抗恶性肿瘤、抗炎、改善血流变及调节免疫等诸多功效[4]。目前大部分研究主要针对药物对个体或个别分子的研究，但如何从整个分子层面上对女贞子-墨旱莲的作用机制、组方依据进行研究，目前尚不明确。

网络药理学（network pharmacology）是基于“疾病－基因－靶点－药物”相互作用网络的基础上，通过网络分析，系统综合地观察药物对疾病网络的干预与影响，揭示多分子药物协同作用的特点[5]。采用系统药理学技术，识别中药活性物质、确定活性物质的作用靶点，并运用网络分析方法建立药物分子、靶点、细胞、组织、器官之间的相互作用网络，明确药效物质和疾病的关系，借以阐明和预测中药疗效和毒性。本研究尝试用网络药理学的方法构建“女贞子-墨旱莲”药对的主要活性物质、靶点的网络模型，以期为阐明“女贞子-墨旱莲”药对的药理作用机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分及靶标的获取

利用中药网络药理学数据及分析平台TCMSP（http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）收集女贞子、墨旱莲的所有化学成分。考虑到药物进入体内不可能全部吸收，故将筛选条件限定为：口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性指数（drug like index，DL）≥0.1。然后根据各个成分的ADME 性质遴选出女贞子-墨旱莲的活性成分及其对应的候选靶标。由于检索到的药物靶标命名不太规范，故使用UniProt 蛋白数据库（http://www.uniprot.org）中的UniProtKB 功能，输入靶点名称并将物种设定为人，检索到靶标的蛋白名称。

1.2 活性成分-靶点的网络构建

将收集到的女贞子、墨旱莲的候选化合物与潜在的靶点利用Cytoscape3.7.0 软件构建出该药对“活性成分-靶点” 相互作用网络模型。运用Network Analyzer 插件进行网络特征的分析。

1.3 生物学过程及通路分析

将女贞子、墨旱莲的靶标蛋白导入到metascape软件（http://metascape.org），得到相应基因列表；然后对基因列表进行富集分析及通路分析。

2 结果

2.1 “女贞子-墨旱莲”药对中的候选活性成分分析

筛选后得到女贞子活性成分18个，墨旱莲活性成分13个，共29个（含有2个共同成分）候选化合物，其中有5个未找到靶标，剩余24个找到靶标248个，11个无人类基因，最终获得靶标237个。女贞子筛选后的成分主要以长蒴黄麻苷（苷元）（olitoriside_qt）、圣草酚（eriodictyol）、金吉苷（苷元）（kingiside_qt）等为主；墨旱莲主要含（Z）-1-（2，4-二羟基苯基）3-3，4-二羟基苯基prop-2-en-1-1 [（Z）-1-（2,4-dihydroxyphenyl）-3-（3，4-dihydroxyphenyl）prop-2-en-1-1]、去甲蟛蜞菊内酯（demethylwedelolactone）、漆黄素（butin）等为主（表1）。

表1 “女贞子-墨旱莲”药对筛选后得到的24个候选化合物

2.2 “活性成分-靶标”网络分析

通过Cytoscape3.7.0 软件绘制出 “女贞子-墨旱莲”药对的“活性成分-靶点”相互作用网络图（图1）。共包括261个节点和495条边，每条边代表靶标与活性成分之间的相互关系。261个节点中包括24个化学成分和248个潜在作用靶标。其中每个活性成分平均作用于20.63（495/24）个靶标，每个靶标链接药物数量平均为2.00（495/248），反映出女贞子-墨旱莲药对发挥药效的过程是以多途径、多环节、多靶标、整体协同的方式完成的。

图1 “女贞子-墨旱莲”候选化合物与靶标相互作用网络图

结果显示，拥有最多潜在靶标的是槲皮素（quercetin），共135个；其次是山萘酚（kaempferol），包含62个；木犀草素（luteolin）含57个，β-谷固醇（β-sitosterol）含37个潜在靶标。这几个化合物可能在女贞子-墨旱莲药对的药理过程中起关键作用。研究显示，槲皮素、山奈酚、木犀草素具有抗肿瘤、抗氧化、抗血小板聚集、抗炎及调节免疫保护神经等多种药理作用[6-9]。β-谷固醇是一种植物固醇，具有较好的降血脂作用[10]。另外，结果显示，靶点括前列腺素G/H 合酶（2PTGS2）、热休克蛋90AB1（HSP90AB1）、核受体辅激活蛋白2（NCOA2）、前列腺素G/H 合酶1（PTGS1）拥有最多的配体。研究显示，PTGS2 主要参与癌症[11]、炎症反应[12]以及心血管疾病，如动脉粥样硬化、血栓性疾病[13]等多种病理过程；HSP90 可以抑制肺腺癌细胞[14]迁移、增殖，诱导肺腺癌细胞凋亡，并且可以增加肺腺癌细胞体外放射敏感性[15]；NCOA2 对脂肪沉积有着重要的调控作用[16]；PTGS1 主要被认为参与细胞间信号传导和维持组织体内平衡。因此，可推测“女贞子-墨旱莲”药对主要在炎性反应、抗肿瘤等领域发挥较好的生物学活性。

2.3 靶标的富集及通路分析

运用metascap 软件对潜在的靶标进行生物学分析。结果显示，“女贞子-墨旱莲”药对的靶标基因主要富集在1123个生物学过程。主要富集过程包括：对无机物的反应（response to inorganic substance）、调节体液水平（regulation of body fluid levels）、活性氧代谢过程（reactive oxygen species metabolic process）、细胞对氮化合物的反应（cellular response to nitrogen compound）、氧水平反应（response to oxygen levels）、对营养水平的反应（response to nutrient levels）、细胞迁移的正调控（positive regulation of cell migration）、上皮细胞凋亡过程（epithelial cell apoptotic process）、血液循环（blood circulation）、凋亡信号通路（apoptotic signaling pathway）、腺发育（gland development）等（图2，见封四）。

图2 富集分析（herbA为女贞子，herb为墨旱莲）

通路分析结果共得到信号通路228条，显著性较高的通路如下：白细胞介素信号（signalingbyinterleukins）、PI3K-Akt 信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌症通路（pathways in cancer）、糖尿病并发症AGR 受体信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、神经活性配体-受体相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）等（表2）。

3 讨论

中医“同病异治，异病同治”的整体观念，为通过网络药理学的方法研究中药提供了新思路。中医治疗主要基于整体观念的思维模式，实现多维调控的复杂理论体系，这与网络药理学基于多靶点的研究策略十分相似。因此，通过“靶点-药物-疾病”相互作用网络去分析中药活性成分的药理机制，找到疾病新靶点的概率可能会增加[17]。

本研究结果从“女贞子-墨旱莲”药对中筛选出候选活性分子24个，预测出248个相应的靶点。通过构建活性成分和靶点网络模型并分析结果发现度值较高的候选活性分子分别是槲皮素、山萘酚、木犀草素、β-谷固醇，度值较高的靶点蛋白为PTGS2、HSP90AB1、NCOA2、PTGS1，这些活性成分和靶点可能是药对中发挥关键作用的物质。通过富集分析和通路分析得出药对中活性成分的靶点主要参与的生物过程包括体液调节、对氧反应、细胞凋亡、神经受体相互作用等，主要在调控肿瘤、炎症与免疫相关类通路发挥其药理作用。本研究结果显示，二至丸可以作用于多个靶点，发挥多种治疗作用，尤其是对肿瘤性疾病。周步高等[18]的研究结果显示，二至丸防治肿瘤机制与其调节肿瘤免疫逃逸和免疫编辑等作用相关。

表2 显著性较高的通路信息

研究结果初步验证了二至丸的作用机制，但本研究也存在一定的局限性。首先中医药在体内代谢的过程十分复杂，在本研究中没有考虑组方量的变化对疗效的影响；其次在TCM 数据库中对二至丸活性成分筛选条件的限制，使有效成分不够全面，且二至丸治疗疾病的疗效欠缺有力的临床实践证据。因此，为进一步阐明二至丸的作用机制，需要进一步基础实验的验证。

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