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肺结核病（pulmonary tuberculosis）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tuberculosis）感染而引起的一种病变累及气管、支气管、胸膜以及肺组织等的呼吸系统的传染性疾病，可通过飞沫经空气传播。肺结核病是世界上最古老、最广泛的传染病之一，虽然治疗结核病抗生素药物的应用与发展已有几十年的历史，但其呈世界范围内流行，全球约1/3 的群体感染M.tuberculosis，且我国是结核病与耐多药结核病负担最高的22个国家之一[1]。近年来，随着耐多药结核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）发病率的不断增加，人类免疫缺陷病毒（HIV）感染合并M.tuberculosis 双重感染引起的病死率增高以及结核病独特的社会因素和医学特性等原因，肺结核已日益威胁到人类的健康[2-3]。此外，结核病是一种与免疫反应密切相关的感染性疾病，结核免疫反应是以T淋巴细胞介导、巨噬细胞为效应细胞的免疫反应，多种细胞因子参与结核病的免疫应答及免疫发病过程；其中γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、白细胞介素-18（interleukin-18，IL-18）与肺结核病的转归、活动性、严重程度、病情预后等密切相关[4-6]，但到目前为止尚缺少明确指导细胞因子局部治疗的临床依据。因此，本研究收集89例肺结核患者的血清和痰液标本，采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）双抗体夹心法分别检测上述3种细胞因子的水平变化，分析各因子的变化在肺结核患者诊疗过程中的价值和意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年11月～2018年12月我院收治的经临床确诊为肺结核患者89例（肺结核组）及我院健康工作者30例（健康对照组）作为研究对象，分别收集其痰液和血清标本。肺结核组中，男56例，女33例；年龄10～82岁，平均（55.6±21.5）岁。健康对照组中，男16例，女14例；年龄28～54岁，平均（39.7±8.4）岁。两组的性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究通过医院医学伦理委员会审批。

纳入标准：①肺结核患者的诊断符合中华医学会结核病学会制定的《结核病诊断和治疗指南》标准[7]；②痰涂片抗酸染色阳性者；③影像学确诊为肺结核；④患者及家属对本研究项目知情并签署知情同意书。

排除标准：①耐药性肺结核；②入院前抗结核治疗；③合并慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）、间质性肺疾病（interstitial lung disease，ILD）等其他肺部疾病；④合并自身免疫性疾病，有心肝肾等重要脏器功能严重障碍，凝血功能障碍者；⑤病例资料不完整者。

1.2 试剂和主要仪器

PBS（1×）（FG701-01）购自北京全式金生物技术有限公司；IFN-γ （EK0373）、OPN （EK0482）、IL-18（EK0864）3种因子应用双抗夹心法，ELISA 检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；酶标仪为Anthos 2010（英国Biochrom 有限公司）。

1.3 标本收集及预处理

肺结核组患者于入院次日晨抽取外周静脉血约3 ml，室温静置，待血液凝固后，3500 r/min 离心15 min，收集患者血清，冻存于-80℃超低温冰箱，待用。患者痰液尽量于应用抗结核药物前收集，晨起收集痰液前，嘱患者用无菌生理盐水漱口3次，深吸气，用力从肺部深处咳出，避免混入鼻咽分泌物，痰液收集于50 ml无菌离心管中，镜检白细胞数＞25个/LP，鳞状上皮细胞＜10个/LP，视为合格痰液标本。对痰液进行预处理：与50 ml 无菌离心管中加入相当于痰液4倍体积的含0.1%二硫苏糖醇（DDT，购自北京索莱宝科技有限公司，D8220），涡旋振荡器震荡30 s，室温静置30 min，加入等体积的无菌PBS（pH=7.4），混匀，2000 r/min 离心15 min，收集痰液上清液，冻存于-80℃超低温冰箱待用。严格按照各试剂盒说明书步骤进行实验操作，预实验评估样品中各待测因子的含量以确定适当的稀释倍数，实验过程中严格进行质量控制。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（

±s）表示，两组间比较采用t检验，不符合正态分布者转换为正态分布后行统计学分析；计数资料用率表示，组间比较采用χ2 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清中IFN-γ、OPN、IL-18水平的比较

肺结核组血清中IFN-γ、OPN、IL-18的水平均高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 两组血清中IFN-γ、OPN、IL-18水平的比较（

±s）

2.2 两组痰液上清液中IFN-γ、OPN、IL-18水平的比较

肺结核组痰液上清液中IFN-γ、OPN、IL-18的水平均高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 两组痰液上清液中IFN-γ、OPN、IL-18水平的比较（

±s）

3 讨论

肺结核病是机体感染M.tuberculosis 引起的一种呼吸系统感染性疾病，约90%的人在感染M.tuberculosis 后无明显临床体征，为隐性感染，仅5%的感染者会发生肺结核病，这与机体的抗结核免疫功能有关。M.tuberculosis 侵入机体可引起机体发生一系列免疫应答反应。CD4+ T淋巴细胞是抗结核免疫应答过程中最重要的一类细胞，根据其产生细胞因子的模式和作用不同分为Th1 和Th2型，其中Th1 为辅助细胞，可分泌IFN-γ、白细胞介素-2（IL-2）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等细胞因子，从而有效增强巨噬细胞的杀菌作用并增强迟发型超敏反应；Th2细胞主要参与体液免疫，刺激B细胞生长分化，增加白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-5（IL-5）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）等细胞因子的分泌[8]。

IFN-γ的本质是一种糖蛋白，主要是CD4+Th1型细胞在受到抗原和有丝分裂原的刺激而分泌产生的一种免疫调节因子，在抗M.tuberculosis 感染免疫反应中起关键作用[9]。国外学者[10]在研究中发现，IFNγ 的浓度水平在结核病患者中显著增高，这表明IFNγ 参与了机体抗结核的免疫反应。但是也有研究[11-12]发现，IFN-γ 水平的降低会导致机体抗结核保护性免疫力有所下降，从而使人体更容易被M.tuberculosis感染。本研究结果显示，IFN-γ 在肺结核患者血清和痰液上清液中浓度高于健康对照组（P<0.05），这与国内研究者袁媛等[13-15]的相关报道基本一致，提示其作用机制主要可能是IFN-γ 激活巨噬细胞，增强其对结核杆菌的吞噬作用[16]，而且增强巨噬细胞的杀菌作用[17]。因此，IFN-γ的水平可反映机体感染部位的局部免疫状态，是一个比较合适的辅助诊断指标。

OPN是一种与细胞免疫的启动密切相关的细胞因子。机体感染M.tuberculosis 后，在巨噬细胞和T淋巴细胞活化的早期阶段，就能产生大量的OPN[18]，且OPN 在M.tuberculosis 感染引起的免疫反应中起着关键作用。Koguchi 等[19]应用BCG 感染体外培养的外周血单个核细胞，发现OPN 的产生先于IL-12 和IFN-γ；加入抗OPN 中和抗体，显著减少了白细胞介素-12（IL-12）和IFN-γ的产生。Ashkar 等[20]利用OPN基因敲除鼠研究发现，巨噬细胞产生IL-12 和IFN-γ的能力显著降低。由此表明，在结核病的免疫反应中，OPN是必需的细胞因子。OPN 作为一种促炎因子，可诱导Th1 介导的免疫反应，使机体免疫反应向有利于清除M.tuberculosis 的方向发展。有学者[18]研究表明，肺结核者血清IL-18 和OPN 可以作为体现肺结核病变严重程度和病变活动性的两个重要敏感指标，在抗结核药物治疗效果的监测方面和病情的临床评估方面均有着极其重要的价值；检测肺结核患者血清OPN水平的变化可作为肺结核活动性和药物疗效的一个早期评估指标[15，21]。OPN 高表达可能是肺结核病变组织区别于正常肺组织的重要特征之一，与结核病的发生相关，可作为结核病辅助诊断的标志物[22]。本研究结果显示，肺结核患者痰液上清液和血清中OPN 水平显著升高，与国内学者[11，15]的研究一致，进一步提示OPN 在抗结核细胞免疫中发挥着重要作用，临床上可用于结核病的辅助诊断、结核病活动性判断、结核化疗疗效评估及测定宿主防御结核感染能力，筛选结核易感人群。

IL-18是一种促炎症细胞因子，由活化的巨噬细胞产生，具有强大的诱导T淋巴细胞产生IFN-γ的能力[23]。IL-18是Th1 细胞和Th2 细胞分化的重要决定因子。IL-18 能促进T细胞和NK 细胞成熟、产生细胞因子及发挥细胞毒性作用。动物实验及临床研究证实，IL-18 在结核发生发展过程中有重要免疫调节作用[24]。IL-18 基因敲除小鼠在感染M.tuberculosis时IFN-γ 产量明显下降并出现肉芽肿炎症反应，而给予外源性IL-18 则可抑制此反应。临床研究同样表明，结核病患者外周血中IL-18 表达与肺部病变程度、临床症状成明显相关性，血循环中IL-18水平也与IFN-γ 成正相关，提示IL-18 在抗M.tuberculosis 感染保护性免疫反应中起重要作用[11-12]。本研究结果显示，肺结核患者血清和痰液上清液中IL-18水平均高于健康对照组（P<0.05），提示IL-18水平可作为评估肺结核患者病情变化的临床辅助指标，与之前学者的研究一致[14]。

综上所述，结核病是一种与免疫反应密切相关的感染性疾病，结核免疫反应是以T淋巴细胞介导、巨噬细胞为效应细胞的免疫反应，多种细胞因子参与结核病的免疫应答及免疫发病过程。本研究通过ELISA方法测定我院肺结核病患者血清及痰液上清液中IFN-γ、OPN、IL-18 三种细胞因子水平的变化情况，且与健康对照组相比，上述细胞因子的水平显著增高，提示肺结核病患者血清及痰上清液中这些细胞因子的水平变化对于临床评估病情、疾病转归及监测抗结核药物疗效具有一定的指导意义，可辅助诊断肺结核，有利于筛选结核易感人群，对于肺结核病患者得到早期诊断、及时合理治疗，提高肺结核患者的发现率和治愈率具有重要的辅助诊断价值。

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