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呼吸系统疾病是一种气管、支气管、肺等部位的病变，多有咳嗽、痰多、胸痛、气喘等症状，重者呼吸困难、缺氧，甚至呼吸衰竭而致死[1]。《中国居民营养与慢性病状况报告（2015年）》指出，目前该疾病在我国慢性病死亡病因中占第3 位[2]。大气颗粒物、吸烟、工业经济发展导致的理化因子、生物因子吸入以及人口年龄老化等因素，使国内外的慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘及肺部感染等疾病的发病率、死亡率有增无减[3]。临床上对伴有炎性反应的常见呼吸系统疾病多使用抗菌药物治疗，然而大多该类疾病并非由细菌感染引起，抗菌药物对此并无治疗效果，反而可导致细菌耐药问题[4]。在临床实践中，传统中医药因可产生良好的抗炎作用而受到广泛关注[5-6]。

本研究观察了清肺抑火胶囊对呼吸系统疾病主要症状的药效学。该胶囊由清肺抑火汤加减而成[7]，具有清肺止咳、降火生津的功效[8]。实验证明其对PM2.5所致的大鼠急性肺部损伤也具有一定的缓解作用[9]。然而，经现代工艺加工成胶囊后，目前缺少该药物对呼吸系统疾病的主要症状，如镇咳、祛痰、平喘等疗效的研究，且其发挥药效的机制仍缺乏现代药理学实验证明。本研究采用二氧化硫刺激引咳法、酚红祛痰法、药物引喘法等动物实验，以及葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium salt，DSS）诱导细胞炎症模型等分别展开实验，旨在探讨清肺抑火胶囊发挥镇咳、祛痰、平喘作用的可能机制，为其临床应用提供实验依据。

1 对象与方法

1.1 实验动物

镇咳及祛痰实验均采用清洁级ICR 小鼠，3月龄，体重35～40 g，雌雄各半；平喘实验采用健康豚鼠，体重200～300 g，雌雄各半。以上动物均购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2018-0006。本研究经上海健康医学院动物医学伦理委员会批准。

1.2 药物及试剂

清肺抑火胶囊（上海方心制药科技有限公司，生产批号：20170502），用药前新鲜配置成低剂量（5 mg/ml）、中剂量（10 mg/ml）及高剂量（20 mg/ml）的混悬液（镇咳和祛痰实验），3、6 及12 mg/ml 的混悬液（平喘实验）；苯海拉明（遂成药业股份有限公司，生产批号：1709251），配置成0.25 mg/ml 的药液；DSS（分子量约50 万，生产厂家：sigmalifescience，生产批号：BCBV7157）。

1.3 仪器

全波长EPOCH 酶标仪（BIOTEK 公司）。

1.4 模型复制

1.4.1 二氧化硫引咳实验[10] 取50 ml 烧杯1 只，内盛0.5 g 无水亚硫酸钠，将盛有50%硫酸的滴定管，置于烧杯上，迅速滴入硫酸5 ml，并立即用钟罩将烧杯扣住，钟罩内充满恒定浓度的二氧化硫气体后，迅速将小鼠放入，观察和记录小鼠的咳嗽潜伏期和2 min 内的咳嗽次数。

1.4.2 酚红祛痰作用实验[11] 实验前，小鼠饥饿18 h，只供饮水。小鼠按各组剂量灌胃，30 min 后按0.2 ml/10 g腹腔注射1%的酚红溶液，注射后30 min 处死，分离气管，接入注射器并用5% NaHCO3 溶液0.8 ml 缓慢注入气管，然后轻轻吸出，如此反复3 次，合并灌洗液，放置10 min 使杂质沉淀，取透明红色上液，用酶标仪在波长545 nm 处，测定其吸光度。

1.4.3 组胺引喘实验[12] 各组豚鼠连续给药灌胃7 d，最后一次灌胃后30 min 将豚鼠置于与医用超声雾化器连接的钟罩内，利用雾化器匀速喷入0.2%的磷酸组胺溶液，持续20 s，记录豚鼠引喘潜伏期（从喷雾开始到哮喘发展或抽搐跌倒的时间）。

1.4.4 DSS 细胞炎症模型及白细胞介素-1β（IL-1β）的含量测定将人肺上皮细胞株A549 细胞（由复旦大学病原生物系赵超课题组惠赠）按1×105 接种于24孔板中，待细胞贴壁后，用1% DSS 预处理1 h，然后分别加入经0.22 μm 除菌滤器过滤的清肺抑火胶囊浸出液，24 h 后收集上清，用ELISA 法（Human IL-1β ELISA MAXTM Deluxe，Biolegend 公司）检测细胞因子IL-1β的表达水平。每个标本做复孔检测，取两次检测的均值作为最终结果。

1.5 实验分组及处理

1.5.1 清肺抑火胶囊的镇咳作用和祛痰作用实验将小鼠随机分为五组，分别设为模型组、低剂量组（150 mg/kg）、中剂量组（300 mg/kg）、高剂量组（600 mg/kg）、阳性对照组（苯海拉明7.5 mg/kg）。其中镇咳实验每组8 只，祛痰实验每组10 只。每只小鼠予以0.3 ml/10 g 药液灌胃，模型组予以0.3 ml/10 g 生理盐水灌胃。

1.5.2 清肺抑火胶囊的平喘作用实验将豚鼠随机分为五组，每组10 只，分别设为模型组、低剂量组（90 mg/kg）、中剂量组（180 mg/kg）、高剂量组（360 mg/kg）、阳性对照组（苯海拉明4.5 mg/kg）。每只豚鼠每次予以3 ml/100 g药液灌胃，模型组予以3 ml/100 g 生理盐水灌胃。

1.5.3 DSS 细胞炎症模型按照清肺抑火胶囊浸出液处理细胞的终浓度分组，分别为低浓度组（1 μg/ml）、中浓度组（2 μg/ml）、高浓度组（4 μg/ml）。

1.6 统计学方法

采用Graphpad Prism 6.0 统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（

±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，并采用Bonferroni 法进行组间的两两比较，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠咳嗽潜伏期及2 min 咳嗽次数的比较

低剂量组小鼠的咳嗽潜伏期及2 min 咳嗽次数与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；中、高剂量组及苯海拉明组小鼠的咳嗽潜伏期长于模型组和低剂量组，2 min 咳嗽次数少于模型组和低剂量组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；中剂量组与高剂量组小鼠的咳嗽潜伏期及2 min 咳嗽次数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；苯海拉明组与中、高剂量组小鼠的咳嗽潜伏期及2 min 咳嗽次数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 各组小鼠咳嗽潜伏期及2 min 内咳嗽次数的比较（

±s）

与模型组比较，*P＜0.05；与模型组比较，**P＜0.01；与低剂量组比较，##P＜0.01；“-”表示无

2.2 各组小鼠呼吸道酚红分泌量的比较

低剂量组小鼠的呼吸道酚红分泌量与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；中、高剂量组小鼠的呼吸道酚红分泌量均高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；低、中、高剂量组小鼠的呼吸道酚红分泌量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；苯海拉明组小鼠的呼吸道酚红分泌量高于模型组及低、中、高剂量组，差异均有统计学意义（P＜0.01）（图1）。

图1 各组小鼠呼吸道酚红分泌量的比较（n=10）

与模型组比较，＊P＜0.05；与模型组比较，＊＊P＜0.01；与低剂量组比较，##P＜0.01；与中剂量组比较，&&P＜0.01；与高剂量组比较，$$P＜0.01

2.3 各组豚鼠引喘潜伏期的比较

低剂量组豚鼠的引喘潜伏期与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；中、高剂量组的引喘潜伏期均长于模型组和低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.01）；高剂量组的引喘潜伏期长于中剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）；苯海拉明组的引喘潜伏期长于模型组及低、中剂量组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；苯海拉明组的引喘潜伏期与高剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图2）。

图2 各组豚鼠引喘潜伏期的比较（n=10）

与模型组比较，＊＊P＜0.01；与低剂量组比较，##P＜0.01；与中剂量组比较，&P＜0.05；与中剂量组比较，&&P＜0.01

2.4 各组细胞培养上清液中IL-1β 水平的比较

DSS 刺激A549 细胞，建立DSS 细胞炎症模型。结果显示，DSS 模型组的细胞培养上清液中IL-1β 水平高于正常细胞组，差异有统计学意义（P＜0.01）。用清肺抑火胶囊处理炎症模型细胞24 h 后，低浓度组细胞培养上清液中的IL-1β 水平高于正常细胞组，差异有统计学意义（P＜0.01）；低浓度组细胞培养上清液中的IL-1β 水平与DSS 模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；中、高浓度组细胞培养上清液中的IL-1β水平低于DSS 模型组和低浓度组，差异有统计学意义（P＜0.05）；中浓度组与高浓度组细胞培养上清液中的IL-1β 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图3）。

3 讨论

清肺抑火胶囊的主要成分具有清热、泻火、利咽、祛痰、免疫抑制、抗炎、抗氧化等作用[13-14]。其功能主治包括清肺止咳、降火生津，临床上还将其用于急性支气管炎风热犯肺型疾病的治疗，可有效缓解患者的临床症状[5]。此外，该药联合抗生素可减轻支气管扩张症急性加重时的发作症状[15]。然而它对肺部疾病的典型症状，如咳、痰、喘的疗效尚未有明确报道。

二氧化硫是一种较强的化学刺激性物质，小鼠吸入后，可直接刺激呼吸道感受器，反射性引起咳嗽。本实验中，给予清肺抑火胶囊后，小鼠出现剂量依赖性的咳嗽潜伏期延长，2 min 内的咳嗽次数减少，提示该药有镇咳作用。其中高剂量清肺抑火胶囊的镇咳作用与苯海拉明相当。

图3 各组细胞培养上清液中IL-1β 水平的比较

与正常细胞组比较，＊＊P＜0.01；与DSS 模型组比较，#P＜0.05；与低浓度组比较，&P＜0.05

小鼠祛痰实验结果显示，随着清肺抑火胶囊剂量的增加，小鼠呼吸道酚红分泌量增大，提示清肺抑火胶囊可增强小鼠气道分泌液体的能力。分泌的液体在呼吸道稀释痰液，达到祛痰作用。

本研究结果显示，清肺抑火胶囊中、高剂量组豚鼠的引喘潜伏期均长于模型组和低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.01），提示清肺抑火胶囊可以延长组胺的引喘潜伏期。组胺具有支气管收缩作用，在支气管哮喘发作中有重要意义。本研究结果还显示，苯海拉明组的引喘潜伏期与高剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。提示清肺抑火胶囊可延长组胺诱导的豚鼠哮喘发作潜伏期，且中、高剂量组的平喘作用与苯海拉明相当。究其原因，清肺抑火胶囊可能通过对抗组胺、抑制支气管收缩，发挥平喘作用。

IL-1β 是一种重要的炎症因子[16]，是哮喘气道平滑肌高反应性的关键调节因子[17-18]，与慢性支气管炎的咳、痰症状有关[19-20]。本研究用DSS 处理人肺上皮细胞株A549 后[21-22]，结果显示IL-1β 分泌增加，而用清肺抑火胶囊处理后，则可明显减少该细胞受炎症刺激后炎症因子的释放，抑制IL-1β 水平，达到抗炎作用。这种抗炎作用可能有助于清肺抑火胶囊镇咳、祛痰及平喘作用的发挥。

综上所述，清肺抑火胶囊剂量依赖的镇咳、祛痰和平喘作用与苯海拉明相似，且可能与其抗组胺和抗炎作用相关。

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