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中药制剂为包含多种物质的复合制剂，不管是何种物质具备抑菌效果[1]，都能够影响到微生物限度检查的精确性，所以对中药制剂进行微生物限度检查时需首先检测方法的适用性，才能保证检查方法的完整性和准确性。本文八种中药制剂为特色制剂，其微生物限度检查法在各级药品标准中均无收载。依据2015 版《中国药典》第四部要求，建立了微生物限度检查法并进行了验证，能客观地反映药物中微生物的污染状况，达到有效、可控的检测目的。

与2010 版《中国药典》相比，2015 版《中国药典》中对微生物限度检查进行了较大的修订[2-3]，培养基更改为广谱性的胰酪大豆琼脂和沙氏葡萄糖琼脂，微生物计数改为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，对回收试验等要求和内容也进行了对应的修订，方法更倾向于与国际接轨。本文针对含有抑菌成分的中药制剂，采用平皿法和薄膜过滤法两种方法去验证，平皿法具有简单、经济的特点；薄膜过滤法具有准确性高，重复性好的特点[4]。通过比较两种方法，开展研究与验证，对该类药物微生物限度检查方法制定有一定参考和借鉴意义，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

YXQWF32-500 卧式榘形压力蒸气消毒器（湖南衡阳医疗器械厂）；BHC-1300ⅡA-B3 型生物洁净安全柜（苏州净化设备有限公司）；SZX 型超净工作台（上海沪南科学仪器联营厂）；LRH-250A 生化培养箱（韶关市泰宏医疗器械有限公司）；CX31 生物显微镜（奥林巴斯）；MJ-160B-Ⅱ霉菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）；HTY HOMO761 匀浆仪（浙江泰林生物技术股份有限公）；420-A 型电热恒温水浴箱（姜堰市新康医疗器械有限公司）；JA2003N 电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；JC101 型电热鼓风干燥箱（上海成顺仪器仪表有限公司、南通嘉程仪器有限公司合作出品）。

1.2 供试品

皮痒宁洗剂、参榆结肠康灌肠液、痔瘘宝洗剂、妇炎宁洗剂、钩蝉头痛宁胶囊、伤科祛瘀片、舒肝行气胶囊、壮腰健步丸的批号信息详见表1。

表1 八个中药制剂的生产信息

1.3 菌种

实验中运用到的菌株其传代次数不可大于5 代[5]，且使用科学的方式进行保存[6]，以保证菌株良好是生物学特点。

金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、生孢梭菌（clostridumsporogens）[CMCC（F）64941]、铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、白色念珠菌（candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（aspergillus niger）[CMCC（F）98003]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、乙型副伤寒沙门菌（salmonella paratyphi B）[CMCC（B）50094]。以上菌种均来自于中国食品药品检定研究院。

1.4 培养基及试剂

胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：3106021）、胰酪大豆胨液体培养基（批号：1074651）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：1064381）、沙氏葡萄糖液体培养基（3105054）、麦康凯琼脂培养基（批号：1064721）、麦康凯液体培养基（批号：3106271）、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（批号：3104915）、甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号：3105002）、梭菌增菌培养基（批号：3104496）、哥伦比亚琼脂培养基（批号：3104758）、RV 沙门增菌液体培养基（批号：3104847）、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（批号：1074121）、肠道菌增菌液体培养基（批号：3105454）、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（批号：3104750）、念珠菌显色培养基（批号：3104798）、三糖铁琼脂培养基（批号：3105052）、硫乙醇酸盐流体培养基（批号：3105365）、pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：3105256）均产自广东环凯微生物科技有限公司；聚山梨酯80（批号：20141022），产自天津市富宇精细化工有限公司；二盐酸N，N-二甲基对苯二胺（批号：1604005），产自阿拉丁试剂（上海）有限公司；氯化钠（批号：20160202-2）、过氧化氢（批号：920150701-1）、丙三醇（批号：20160201-1），产自广州化学试剂厂。

本研究所用到的培养基均按使用说明配制及消毒，所用试剂也要按需经过121℃，30 min 蒸汽灭菌[7]。

2 方法与结果

参照2015 《中国药典》版四部“1105、1106、1107”微生物限度检查法[8]进行验证。

2.1 供试品溶液的制备方法设计

2.1.1 不含药材原粉的胶囊剂供试品制备

钩蝉头痛宁胶囊、舒肝行气胶囊，分别称取10 g，用匀浆仪打碎，加入100 ml 胰酪大豆胨液体培养基，慢慢摇至均匀，制成1∶10 供试品，再用胰酪大豆胨液体培养基作为稀释液，配制1∶100 供试品[9]。

2.1.2 含药材原粉的固体制剂制备

伤科祛瘀片、壮腰健步丸，分别称取10 g，加入100 ml 胰酪大豆胨液体培养基，用匀浆仪制成1∶10供试品，再用胰酪大豆胨液体培养基作为稀释液，配制1∶100 供试品[10]。

2.1.3 外用液体供试品制备

皮痒宁洗剂、参榆结肠康灌肠液、痔瘘宝洗剂、妇炎宁洗剂，各取一瓶摇匀，作为供试品，再各取10 ml，以胰酪大豆胨液体培养基作为稀释液，分别制成1∶2供试品、1∶5 供试品、1∶10 供试品、1∶20 供试品[11]。

2.2 菌液制备

2.2.1 高浓度菌悬液的制备

依次将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、沙门菌的新鲜培养物接种到胰酪大豆胨液体培养基内，该培养基体积为100 ml，将生孢梭菌接种到硫乙醇酸盐流体培养基内，体积同样为100 ml，然后置于温度为30～35℃生化培养箱内，连续培养18～24 h；将白色念珠菌接种至沙氏葡萄糖液体培养基内，体积同样为100 ml，然后置于温度为20～25℃的培养箱内培养2～3 d；依次量取10 ml 的培养物，除生孢梭菌的培养物需使用硫乙醇酸盐流体培养基进行稀释外，其他种类的培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释，分别取各培养物10 ml，加稀释液90 ml，按10 倍递增稀释级数制成每毫升含菌数为1000～10 000 cfu 的菌悬液。

将黑曲霉培养物接种到沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDB）表面，然后置于温度为20～25℃的生化培养箱内，连续培养5～7 d，之后用含0.05%（ml/ml）吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液冲洗孢子。然后借助无菌吸管把孢子悬液转移至无菌烧瓶中，用上述冲洗液将悬液稀释成含菌数1000～10 000 cfu/ml 的孢子悬液。

2.2.2 低浓度菌悬液的制备

取“2.2.1”项下制备的各菌悬液，进一步稀释成含菌数小于100 cfu/ml 的菌悬液，用于定性致病菌检查方法及微生物计数法中薄膜过滤法的研究。

2.3 供试品微生物计数方法的设计

2.3.1 平皿法设计

需氧菌总数[12]：固体制剂选用（1∶10，1 ml）供试品和（1∶100，1 ml）供试品，必要时选用（1∶1000，1 ml）和（1∶10 000，1 ml）。

液体制剂选用（原液，1 ml）供试品和（1∶10，1 ml）供试品，必要时选用（1∶20，1 ml）供试品和（1∶50，1 ml）供试品。

霉菌和酵母菌总数：固体制剂选用（1∶10，1 ml）供试品，必要时选用（1∶20，1 ml）供试品。

液体制剂选用（原液，1ml）供试品和（1∶2，1 ml）供试品，必要时选用（1∶5，1 ml）供试品和必要时选用（1∶10，1 ml）供试品。

2.3.2 平皿法回收率的设计

2.3.2.1 试验组取选用浓度的供试品，每份100 ml，依次添加“2.2.1”项下金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉，添加量需小于1 ml。吸取1 ml 移至平皿内，制作2 个平行样，倒入相应的培养基。

2.3.2.2 菌液对照组取pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液代替“试验组”的供试品，同法制备。

2.3.2.3 供试品对照组取pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液代替“试验组”的菌悬液，同法制备。

上述相应的培养基及培养温度为：对需氧菌进行统计时需使用胰酪大豆胨琼脂培养基在30～35℃的条件下进行培养；对霉菌于酵母菌进行统计时需使用沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDB）在20～25℃的温度中培养。

2.3.3 薄膜过滤法计算微生物回收率的设计

2.3.3.1 试验组取1∶10 供试液10 ml，抽滤过，选择一定量pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，100 ml/次，于末次冲洗结束之后，加入“2.2.2”的相应菌悬液1 ml，滤过，取出滤膜，平行制备2 张贴膜，分别贴于相应培养基上培养[13]。

2.3.3.2 菌液对照组按薄膜过滤法，加入“2.2.2”的相应菌悬液1 ml，滤过，取出滤膜，平行制备2 张贴膜，分别贴于相应培养基上培养。

2.3.3.3 供试品对照组取pH 7.0 的氯化钠-蛋白胨缓冲液代替“试验组”的菌悬液，同法制备。

上述相应的培养基及培养温度为：需氧菌计数所使用到的贴膜贴在胰酪大豆胨琼脂培养基平皿中30～35℃的条件下培养；霉菌与酵母菌计数所使用到的贴膜贴在沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDB）平皿中20～25℃的温度中培养。

2.3.3.4 预实验采用金黄色葡萄球菌作为试验菌株进行预实验，结果使用200 ml 缓冲液，每次100 ml，八个品种的回收率能达到0.5～2.0，初步确认使用薄膜过滤法（200 ml）可以消除制剂的抑菌作用。

2.3.4 回收率的计算

各菌株的回收率=（试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数）/菌液对照组的平均菌落数×100%

按照要求，回收率在0.5～2.0 之间，供试品3 个批次中若有1 个超出比值，需用进一步用适宜的方法进行试验。计算各试验菌株回收率，结果见表2。

2.4 控制菌检查方法的设计及验证

根据八种制剂的处方、工艺、剂型等特点，本设计需进行耐胆盐革兰阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌、白色念珠菌等方法适应性研究，所试验的菌种包含了药典全部致病菌。（注：若阳性对照组没有显示出对应菌株活性，则该浓度下菌株被抑制，需各组再等量加入稀释液稀释，直到阳性对照组的致病菌菌株被培养出来。）

2.4.1 耐胆盐革兰阴性菌检查验证试验

取2.1 项下1∶10 供试液于20～25℃培养2 h，成为预培养供试液[14]。

供试品对照组：取10 ml 预培养物供试液加入10 ml 肠道菌增菌液体培养基。

阳性（大肠埃希菌）组：照供试品组配制，再加入“2.2.2”项下大肠埃希菌液1 ml。

阳性（铜绿假单胞菌）组：照供试品组配制，再加入“2.2.2”项下铜绿假单胞菌液1 ml。

阴性组：以胰酪大豆胨液体培养基代替“预培养物”，照供试品组配制，再加入稀释液1 ml。

放于30～35℃的生化培养箱内培养24～48 h，之后划线接种在紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基的平板中，在同一温度条件的培养箱内进行培养，分析与记录菌落状态。结果见表3。

表2 微生物计数方法适应性验证结果

“-”代表无需进行实验

表3 2 品种耐胆盐革兰阴性菌验证结果

2.4.2 大肠埃希菌检查验证试验

供试品对照组：取2.1 项下1∶10 供试液10 ml 加入到100 ml 胰酪大豆胨液体培养基，再加入稀释液1 ml。

阳性（大肠埃希菌）组：按照供试品组，取“2.2.2”项下大肠埃希菌液1 ml 代替稀释液进行配制。

阴性对照组：按照供试品组，取稀释液10 ml 代替“1∶10 供试液”进行配制。

置30～35℃的生化培养箱中培养18～24 h 后，将其1 ml 添加至100 ml 麦康凯液体培养基上，放于42～44℃条件下培养24～48 h，之后划线接种在麦康凯琼脂平板中[15]，于30～35℃条件下培养18～72 h，并分析与记录菌落状态。结果见表4。

2.4.3 沙门菌检查验证试验

供试品对照组：取2.1 项下1∶10 供试液100 ml，再加入稀释液1 ml。

阳性（沙门菌）组：按照供试品组，取“2.2.2”项下沙门菌液1 ml 代替稀释液进行配制。

阴性对照组：按照供试品组，取稀释液100 ml 代替“1∶10 供试液”进行配制。

放于30～35℃的生化培养箱内培养18～24 h 之后，将0.1 ml 培养物，接种到10 ml RV 沙门增菌液体培养基上。于30～35℃条件下培养18～24 h，之后划线接种在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂的培养基中。于30～35℃条件下培养18～48 h，借助接种针筛选疑似菌落，并给予斜面与高层穿刺处理，继而接种在三糖铁琼脂培养基中，在30～35℃条件下培养18～24 h，并分析与记录菌落状态[16]。检查沙门菌：钩蝉头痛宁胶囊加入培养基的体积不少于200 ml，舒肝行气胶囊加入培养基的体积不少于300 ml。结果见表5。

表4 4 品种大肠埃希菌验证结果

表5 4 品种沙门菌验证结果

2.4.4 铜绿假单胞菌检查验证试验

供试品对照组：把2.1 项下1∶10 供试液添加至100 ml 胰酪大豆胨液体培养基内，再加入稀释液1 ml。

阳性（铜绿假单胞菌）组：按照供试品组，取“2.2.2”项下铜绿假单胞菌液1 ml 代替稀释液进行配制。

阴性对照组：按照供试品组，取稀释液10 ml 代替“1∶10 供试液”进行配制。

置30～35℃的生化培养箱中培养18～24 h 后，划线接种至溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72 h，后挑疑是菌落做过氧化酶试验，若培养物30 s 内呈粉红色并逐渐变为紫红色则为氧化酶试验阳性[17]。结果见表6。

2.4.5 金黄色葡萄球菌检查验证试验

供试品对照组：将2.1 项下1∶10 供试液添加至100 ml胰酪大豆胨液体培养基内，之后添加稀释液1 ml。

阳性（金黄色葡萄球菌）组：按照供试品组，取“2.2.2”项下金黄色葡萄球菌液1 ml 代替稀释液进行配制。

表6 4 品种铜绿假单胞菌验证结果

阴性对照组：按照供试品组，取稀释液10 ml 代替“1∶10 供试液”进行配制。

置30～35℃的生化培养箱中培养18～24 h 后，划线接种至甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72 h，观察菌落形态[18]。结果见表7。

表7 4 品种金黄色葡萄球菌验证结果

2.4.6 梭菌检查验证试验

供试品组：取2.1 项下1∶10 供试液2 份，每份10 ml，其中一份置80℃保温10 min 后冷却。上述2 份供试液各加入1 ml 稀释液并分别接种至100 ml 梭菌增菌培养基中。

阳性对照组：按照供试品组，取“2.2.2”项下梭菌菌液1 ml 代替稀释液进行配制。

阴性（梭菌）组：按照供试品组，取稀释液10 ml代替“1∶10 供试液”进行配制。

置厌氧条件下30～35°C 培养48 h 后，涂抹接种至哥伦比亚琼脂培养基平板上，厌氧条件下30～35℃培养48～72 h，取疑是菌落滴加3%过氧化氢试液，若菌落表现有气泡产生，则为阳性[19]。

结果提示，使用100 ml 梭菌增菌培养基，阳性（梭菌）组即显示出梭菌活性。

2.4.7 白色念珠菌检查验证试验

供试品组：取2.1 项下1∶10 供试液加入到100 ml沙氏葡萄糖液体培养基中，再加入稀释液1 ml。

阳性（白色念珠菌）组：按照供试品组，取“2.2.2”项下白色念珠菌液1 ml 代替稀释液进行配制。

阴性对照组：按照供试品组，取稀释液10 ml 代替“1∶10 供试液”进行配制。

置30～35℃的生化培养箱中培养72～120 h 后，划线接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养24～48 h，然后挑选疑是菌落接种至念珠菌显色培养基平板上[20]，观察菌落形态。

结果提示，使用100 ml 沙氏葡萄糖液体培养基，阳性（白色念珠菌）组即显示出白色念珠菌活性。

3 讨论

本文中八种医院中药制剂均含有抑菌成分，通过试验，建立了微生物限度检查方法。其中，需氧菌总数计数用平皿稀释法和薄膜过滤法，霉菌和酵母菌计数：皮痒宁洗剂用1∶2 稀释，参榆结肠康灌肠液、痔瘘宝洗剂、妇炎宁洗剂用原液，钩蝉头痛宁胶囊、伤科祛瘀片、舒肝行气胶囊、壮腰健步丸用1∶10 稀释，回收率在0.5～2.0 之间。由“2.4”的试验可见，八种医院制剂的致病菌检查，除检查沙门菌时，钩蝉头痛宁胶囊稀释液用200 ml，舒肝行气胶囊的稀释液用300 ml外，其余用常规法，各控制菌均可被检查出来。

2015年版《中国药典》，其修订后的中国药典微生物检验系统与国外完全一致。使原本国内国外有两套微生物检验方法的生产企业，大大的减少了检验成本。

药典上的致病菌验证没有明确规定要做供试品对照组，本文加入供试品对照组的目的是为了证明供试品没有被污染，更加有力的证明方法可行性。

胶囊剂型或皂苷类成份多的中药制剂，用匀浆仪加液后打碎容易产生泡沫，对加入的菌种会有影响，可选择打碎后加入稀释液，再搅拌均匀。

微生物试验时，中药胶囊剂常常会遇到胶囊壳不易溶解的情况，为了不影响填充物内的微生物生长，可将打匀后的胶囊液置45℃水浴并时时震摇，使溶解[21]。

本研究建立了皮痒宁洗剂、参榆结肠康灌肠液、痔瘘宝洗剂、妇炎宁洗剂、钩蝉头痛宁胶囊、伤科祛瘀片、舒肝行气胶囊、壮腰健步丸的微生物限度检查，所用菌株涵盖了2015 版《中国药典》的所有试验菌株。试验菌株的稀释浓度会因其活性生物，接种量、生长温度、培养时间、活化代数、个人操作等影响，笔者所探究的所有试验菌株浓度依次为：铜绿假单胞菌8×106 cfu/ml、枯草芽孢杆菌107 cfu/ml、金黄色葡萄球菌5×108 cfu/ml、白色念珠菌7×106 cfu/ml、大肠埃希菌3×108 cfu/ml、乙型副伤寒沙门菌2×108 cfu/ml、黑曲霉和生孢梭菌可以稀释制备成同浓度多份，孢子悬液保存于2～8℃，在验证贮存期内使用，测定其中1份浓度即可。试验菌株浓度在药典上没有公布，在同类文献中亦少见，现列出培养后的菌株浓度可供同行人员参考。

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