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酮洛芬的化学名为3-苯甲酰基-α-甲基苯乙酸，是一种优良的2-芳基丙酸类非甾体抗炎镇痛药[1]。其作用机制主要是通过抑制体内环氧合酶（COXs）、脂氧化酶（LOXs）的生物活性，从而抑制致炎物质前列腺素（PGs）、白三烯（LTs）的合成，酮洛芬还具有对抗缓激肽释放、清除羟自由基以及稳定溶酶体膜活性，产生良好的解热、镇痛和抗炎作用[2]。临床研究表明[3]，酮洛芬是治疗类风湿性关节炎疾病的首选药物[4]，国外还用于治疗牙痛、术后疼痛、癌性疼痛和红斑狼疮、支气管炎等疾病[5]，对于软组织受伤的治疗效果也非常好[6]。

酮洛芬凝胶是酮洛芬的新型载体-传递体（transfersome）凝胶制剂，主要用于骨性关节炎、肩关节周围炎、肌腱炎等疾病的镇痛治疗[7]。传递体载体能用于靶向用药部位之下的肌肉和关节，因为它们不会被局部的皮下微循环所清除[8]，可提高局部药物浓度，增强药效[9]。近年来对酮洛芬凝胶进行研究，为抑制软组织损伤相关性疼痛提供了一种有前途的方法[10]。

1 材料与方法

1.1 仪器

UltiMate 3000高效液相色谱仪（美国戴安）；AUW 220D电子分析天平（日本岛津）；ZORBAX SB-Phenyl（4.6 mm×250 mm，5 μm）；CSH-1000 GSD-1 型综合药品稳定性试验箱（重庆创测科技有限公司）。

1.2 药物与试剂

酮洛芬凝胶（武汉诺安药业有限公司，批号：20170401、20170402、20170403）；市售酮洛芬凝胶（A.Menarini Industrie Farmaceutiche Riunite S.r.l.，批号：269、270；商品名：法斯通凝胶）；酮洛芬对照品（由中国食品药品检定研究院提供，批号：100337-201104）；酮洛芬杂质A对照品（由欧洲药典委员会提供，批号：00IFG7、00H5N6）；酮洛芬杂质B对照品（由CatoResearchChemicals Inc 提供，批号：C4X-14712-1407）；酮洛芬杂质C对照品（由欧洲药典委员会提供，批号：0022rJ、0022tD）；酮洛芬杂质D对照品（由Cato Research Chemicals Inc提供，批号：C4X-14714-1505）；酮洛芬杂质E对照品（由 CatoResearchChemicalsInc提供，批号：C4X-14715-1504）；酮洛芬杂质F对照品（由Cato Research Chemicals Inc 提供，批号：C4X-14716-1309）；酮洛芬乙酯对照品（由Cato Research Chemicals Inc提供，批号：C4X-147111-1507）。

乙腈（色谱纯，Merck）；三氟乙酸（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；氯化钠（台山市新宁制药有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用 ZORBAX SB-Phenyl（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，以0.15%三氟乙酸-乙腈溶液为流动相A，以0.15%三氟乙酸溶液为流动相B，检测波长设为254 nm，柱温设为 30℃，流速为1.3 ml/min，进样量20 μl，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液的配置

2.2.1 供试品溶液取酮洛芬凝胶约1 g，精密称定，置25 ml量瓶中，加0.15%三氟乙酸-乙腈溶液－0.15%三氟乙酸溶液（20∶80）（以下称稀释剂）20 ml和氯化钠2 g，振摇，使氯化钠溶解，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液（1 mg/ml）。

2.2.2 原料供试品溶液取酮洛芬原料药20 mg，精密称定，置20 ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 空白辅料溶液取不含酮洛芬的空白凝胶约1 g，精密称定，置25 ml量瓶中，加稀释剂约20 ml和氯化钠2 g，振摇，使氯化钠溶解，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为空白辅料溶液。

2.2.4 对照品溶液精密量取“2.2.1”项下的供试品溶液适量，加稀释剂定量稀释成浓度约为2 μg/ml的对照品溶液。

2.2.5 系统适用性溶液取酮洛芬原料约50 mg，置50 ml量瓶中，再分别精密量取酮洛芬杂质A、B、C、D、E、F和酮洛芬乙酯对照品储备液各1 ml置同一50 ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.6 杂质对照品溶液取酮洛芬杂质A、B、C、D、E、F和酮洛芬乙酯对照品适量，精密称量，加稀释剂溶解并稀释成浓度约为100 μg/ml的杂质对照品储备液。精密量取各杂质对照品储备液1～50 ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，得浓度约为2 μg/ml各杂质对照品溶液。

2.3 系统适用性试验

精密量取“2.2.5”项下的系统适用性溶液 20 μl，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图（图1），结果表明各杂质峰与主峰分离度良好，相互之间不会形成干扰，保留时间及分离度见表2。

图1 系统适用性试验色谱图

表2 系统适用性试验结果

“-”表示无数据

2.4 专属性试验

2.4.1 制剂光破坏取本品约1 g，精密称定，置25 ml量瓶中，加稀释剂约20 ml和氯化钠2 g，振摇，使氯化钠溶解，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，置4500Lx±500Lx的强光下照射26 h，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。

2.4.2 制剂酸破坏取本品约1 g，精密称定，置25 ml量瓶中，加稀释剂约20 ml和氯化钠2 g，加1 mol/L盐酸溶液2 ml，振摇，使氯化钠溶解，避光放置4 h后，用1 mol/L氢氧化钠溶液2 ml中和，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。

2.4.3 制剂碱破坏取本品约1 g，精密称定，置25 ml量瓶中，加稀释剂约20 ml和氯化钠2 g，加1 mol/L氢氧化钠溶液2 ml，振摇，使氯化钠溶解，避光放置4 h后，用1 mol/L盐酸溶液2 ml中和，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。

2.4.4 制剂热破坏取本品约1 g，精密称定，置25 ml量瓶中，加稀释剂约20 ml和氯化钠2 g，振摇，使氯化钠溶解，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，置100℃水浴中破坏4 h后，冷却至室温，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。

2.4.5 氧化破坏取本品约1 g，精密称定，置25 ml量瓶中，加稀释剂约20 ml和氯化钠2 g，振摇，使氯化钠溶解，加30%的H2O22 ml，摇匀，避光放置20 h后，于80℃水浴中加热2 min，冷却至室温，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。

按上述拟定的色谱条件，分别取制剂的酸、碱、光、热、氧化破坏溶液进样，记录色谱图。结果表明，酮洛芬凝胶的酸、碱、光、热、氧化破坏溶液进样，各降解产物峰与主峰之间的分离度均符合规定。

2.5 精密度试验

取“2.2.5”项下的系统适用性溶液，在上述拟定的色谱条件下连续进样6针，结果表明，各杂质及主峰的RSD均＜2%，符合药典要求，详见表3。

表3 系统适用性溶液精密度峰积测定结果

2.6 稳定性试验

取本品凝胶（批号 2017401）按“2.2.1”项下的测定方法，配置供试品溶液，在室温下放置 0、2、4、6、8、12 h后进样，记录色谱图，考察样品溶液的稳定性。结果显示，凝胶中杂质C峰面积的RSD=0.96%，保留时间的RSD=0.18%，表明样品溶液在室温条件下放置12 h稳定。

2.7 定量限与检测限考察

取杂质 A、B、C、D、E、F 及酮洛芬乙酯对照品溶液，分别进样进行测定，当信噪比（S/N）约为10时，杂质 A、B、C、D、E、F 及酮洛芬乙酯的定量限分别为0.6、0.6、1.0、1.6、0.8、1.6、0.8 ng。当信噪比（S/N）≥3 时，杂质 A、B、C、D、E、F 及酮洛芬乙酯的检测限分别为0.2、0.2、0.3、0.5、0.2、0.5、0.3 ng。

2.8 样品测定

取批号为 20170401、20170402、20170403 三批样品及市售样品（269），照上述确定方法检查其有关物质，结果见表5。三批样品及市售样品均未检出杂质A、杂质C、杂质F，各样品中均检出杂质B、杂质D、杂质E及酮洛芬乙酯。

表5 酮洛芬凝胶有关物质检查结果（%）

3 讨论

3.1 检测波长的选择

酮洛芬原料EP 8.0版和USP 38版中有关物质检查方法为HPLC法，检测波长为233 nm。酮洛芬凝胶进口药品注册标准中有关物质的检测方法为HPLC 法[11]，检测波长为 255 nm。取上述“2.2.5”项下的系统适用性溶液各20 μl，分别在255、233 nm的波长条件下进样，确定各杂质与主峰在各波长条件下的检出情况。检测结果表明，254 nm波长条件下杂质的检出效果明显优于233 nm，杂质B、D、E、F和酮洛芬乙酯的最大吸收波长与酮洛芬凝胶进口药品注册标准中有关物质检测波长一致。故本实验将255 nm作为酮洛芬凝胶有关物质检测的波长，优化酮洛芬凝胶有关物质的检测条件[12]。

3.2 酮洛芬有关物质的检测方法制定

文献中酮洛芬凝胶有关物质的检查方法，和EP 8.0版质量标准中有关物质检测的色谱条件一致[13]。有机相均为乙腈，水系分别为0.15%三氟乙酸溶液和磷酸盐缓冲液，水系中盐的成分均较少，作用是调整基线和峰形。如果将文献中梯度洗脱程序中有机相的比例调整至和EP 8.0版一致，即将第二步梯度（75 min）的有机相比例由31%增加到45%，将水系比例由69%降低至55%，同时对第三步梯度进行修改，即保持换相后的第二步梯度的浓度，以保证酮洛芬乙酯可有效洗脱。按此条件，可以达到较好的分离效果，且所得图谱各峰峰形比较好，对酮洛芬凝胶有关物质[14]的检测的色谱条件进行了优化。

3.3 小结

《日本药典》17 版[15]、《美国药典》40 版[16]、《欧洲药典》8.0版本[17]中均采用HPLC法对酮洛芬进行有关物质的分析，但仅EP 8.0版[18]中给出了6种已知杂质的保留时间。对于酮洛芬凝胶制剂的研究则更少[19]，仅BP 13版中收载了有关物质检测标准，但检测方法为TLC法，且仅检测了酮洛芬乙酯杂质[20]。本实验对酮洛芬凝胶中杂质的检测进行了优化：①将USP 38版和EP 8.0版中规定的C18柱修改成了苯基柱；②将USP 38版和EP 8.0版中规定的流动相体系：磷酸盐缓冲液-水-乙腈（2∶55∶43）等度洗脱修改了以 0.15%三氟乙酸溶液和0.15%三氟乙酸乙腈溶液按一定比例进行梯度洗脱的方式。本实验建立的方法检查酮洛芬凝胶的有关物质，也为主成分的鉴别及含量测定提供了依据。

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