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肺癌是近年来发病率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（non-samll cell lung cancer，NSCLC）占 80%～90%[1-2]。吉非替尼是第一代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosinek inase inhibitor，EGFR-TKI）类药物，是治疗晚期NSCLC EGFR突变人群的首要选择，但治疗后大部分患者会产生获得性耐药[3-4]。ATP结合膜转运蛋白超家族G成员 2 （ATP-binding cassette superfamily G member 2，ABCG2）通过外排泵作用，促进细胞内化疗药物主动外排，参与多种肿瘤耐药机制[5-6]。既往研究表明[7-8]，耐厄洛替尼的人肺腺癌细胞株（A549/ER）相对于A549细胞株ABCG2表达升高，由于厄洛替尼与吉非替尼均属于EGFR-TKI类药物，但其药理学特性不同，所以吉非替尼的耐药亦可能与ABCG2有关。本课题通过对ABCG2在NSCLC吉非替尼耐药中的作用及其介导耐药的信号路径的研究，对于吉非替尼耐药的NSCLC的治疗有重要意义，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞材料人非小细胞肺腺癌吉非替尼敏感细胞株A549购自上海复祥生物科技有限公司，吉非替尼耐药非小细胞肺癌细胞株A549/GR由本实验室诱导所得。

1.1.2 一般资料收集2015年4月～2017年4月我院收治的NSCLC患者及健康人的血清，分为NSCLC非耐药组（20例）、NSCLC吉非替尼耐药组（20例）和健康者组（20例）。NSCLC非耐药组研究对象的年龄39～80岁；男 7例，女 13例；腺癌 17例，鳞癌 2例，腺鳞癌1例。NSCLC吉非替尼耐药组研究对象的年龄43～76岁；男5例，女15例；腺癌19例，腺鳞癌1例。健康者组研究对象的年龄31～75岁，男9例，女11例。三组的一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会审核及同意。

1.1.3 药品与试剂吉非替尼购自阿斯利康公司（250 mg/片）。一抗：GAPDH（武汉博士德公司）；ABCG2（Abcam 公司）；p-AKT（Abcam 公司）；二抗：辣根过氧化物酶（汉博士德公司）；PRMI1640培养基及胎牛血（Hyclone公司）；MTT（Sigma公司）；ABCG2 酶联免疫分析试剂盒（cusabio公司）。Thermo Multikan MK3酶标仪（Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将A549细胞株应用含10%胎牛血清的PRMI1640于37℃、5%CO2的培养箱中进行养育。将A549/GR细胞株置于含有浓度为1 μmol/L吉非替尼的10%胎牛血清的PRMI1640，于37℃、5%CO2培养箱中培养，实验对象为对数生长期细胞。

1.2.2 A549/GR细胞的耐药性检测将A549及A549/GR细胞分别加入100 μl呈半数药物浓度梯度的培养基，各设置 7 个浓度梯度组（0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L）及空白对照组，培养后加入 MTT，浓度5 mg/ml，培养 4 h 后，吸出培养基，加入 150 μl二甲基亚砜（DMSO），轻微振荡后用酶标仪检测吸光度（A）值（波长490 nm）。用下列公式进行计算：

细胞存活率=（实验组A值/对照组A值）×100%，耐药指数=耐药细胞半抑制浓度（IC50）/亲代细胞IC50

1.2.3 ABCG2、p-AKT 蛋白在 A549、A549/GR 细胞的表达用吉非替尼分别处理A549、A549/GR，细胞裂解后，提取总蛋白，应用BCA法行蛋白定量。在120 V下持续电泳至样品到达凝胶底部。半干转膜仪转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，洗膜后，剪下相应条带，分别放入 GAPDH、ABCG2、p-AKT 多克隆一抗中（1∶1000稀释），4℃冰箱孵育过夜。次日，将PVDF膜从一抗中取出，洗膜缓冲液（TBST）洗脱 3 次，置于二抗（1∶2000稀释）中，于摇床上摇动，洗脱3次。最后将配好的电化学发光（ECL）液滴加覆盖PVDF膜。使用超灵敏化学发光仪进行曝光，选择合适曝光时间，观察分析曝光的条带情况。

用浓度为100 ng/ml的胰岛素样生长因子-1（IGF-1）及浓度为20 μmol/L的LY294002分别处理A549、A549/GR细胞48 h，用上述同样方法检测蛋白的表达。

1.2.4 检测细胞中ABCG2外排取A549细胞及A549/GR细胞作为对照，在A549细胞和A549/GR细胞中分别加入IGF-1、LY294002，将4组细胞各加入1 μg/ml Rh123培养 24 h，使用流式细胞仪检测ABCG2外排情况。

1.2.5 检测健康人、NSCLC非耐药组及非小细胞肺癌吉非替尼耐药组患者中ABCG2表达收集患者清晨空腹静脉血，静置取上层血清，按酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒操作说明，进行ELISA检测血清中ABCG2水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差

s）表示，两组间比较采用t检验，多组建比较采用单因素方差分析；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 A549/GR细胞的耐药性检测

吉非替尼对A549细胞及A549/GR细胞的抑制作用，随浓度的升高而增强（P＜0.05）。浓度相同，A549/GR的细胞存活率高于A549细胞（图1）。吉非替尼对A549/GR的 IC50为 47 μmol/L，吉非替尼对A549细胞的IC50为3.5 μmol/L，耐药指数为13.4。

与同组前一个浓度比较，*P＜0.05

2.2 ABCG2、p-AKT 蛋白在 A549、A549/GR 细胞的表达

Western Blot检测耐药相关蛋白，结果显示，耐药细胞A549/GR中的ABCG2和p-AKT均高于亲代细胞 A549（图 2）。

图2 Western Blot检测A549/GR及A549细胞中ABCG2和p-AKT蛋白表达

IGF-1作用的 A549细胞、p-AKT、ABCG2蛋白表达提高（P＜0.05）。LY294002 作用 A549/GR 细胞、p-AKT、ABCG2 均下调（P＜0.05）（图 3）。

图3 Western blot检测IGF-1及LY294002作用A549、A549/GR细胞后p-AKT、ABCG2蛋白表达

2.3 检测细胞中ABCG2外排

IGF-1作用A549细胞后，较未加入激活剂的A549 细胞，其外排作用增强（P＜0.05）。LY294002 作用A549/GR细胞后，较未加入激活剂的A549/GR细胞，其外排作用减少（P＜0.05）（图 4）。

2.4 检测健康人、NSCLC非耐药组及NSCLC吉非替尼耐药组患者中ABCG2表达

检测健康人、NSCLC非耐药组及NSCLC吉非替尼耐药组患者的ABCG2表达分别为（98.6±6.8）ng/ml、（209.5±8.2）ng/ml及（326.7±10.3）ng/ml。健康人的ABCG2表达明显低于 NSCLC非耐药组患者（P＜0.05），NSCLC吉非替尼耐药组患者的ABCG2表达均高于NSCLC非耐药组患者及健康人（P＜0.05）。

3 讨论

图4 检测细胞中ABCG2外排

A：A549 细胞；B：A549 细胞 100 μg/ml ICF-1 作用后；C：A549/GR 细胞；D：A549/GR 细胞 20 μmol/L LY294002 作用后，与 A 比较，*P＜0.05；与 C比较，#P＜0.05

EGFR-TKI是目前晚期NSCLC EGFR突变患者的一线治疗选择，其耐药机制已成为临床研究的重点。早在1970年Biedler等[9]就首次报道肿瘤存在多药耐药（multidrug resistance，MDR）现象。癌细胞多药耐药性形成的重要原因是ABC转运体的异常表达[10-11]。人类基因组编码ABC转运体有49个，包括A～G 7个亚家族，其中最少有16个转运体已被证实具有药物外排功能[12]。ABCG2属于ABC转运体家族中的一员，最早是在乳腺癌耐药细胞株中被发现，是一种半转运体[13]。有研究证实ABCG2与吉非替尼、厄洛替尼等相结合可导致药物主动外排到胞外，进而抑制其生物活性，产生耐药[14-15]。本研究着重于探讨ABCG2在吉非替尼耐药的非小细胞肺癌中作用及其调控耐药的机制。

Ho 等[16]从 H460、H23、HTB-58、A549、H441、H2170六种肺癌细胞系中分离出的侧群细胞中ABCG2高表达。一项中国台湾的研究显示[17]，对于吉非替尼耐药的EGFR野生型的非小细胞肺癌中，其耐药与ABCG2相关，而且ABCG2表达过多可提示对吉非替尼的疗效差。本研究结果提示，Western Blot检测耐药相关蛋白，耐药细胞A549/GR中的ABCG2和p-AKT均高于亲代细胞A549，证明了耐药细胞中ABCG2的表达要明显高于正常肿瘤细胞（P＜0.05）。与以上研究基本一致，但本课题缺乏对ABCG2影响肿瘤治疗预后的研究，有待进一步的研究。

磷醇酰肌醇3激酶/丝苏氨酸蛋白激酶（phpsphatidylinositol 3-kinase/serine-threonine kinase，PI3K/AKT）通路激活剂IGF-1可在体外激活PI3K/AKT信号通路，激活AKT活化，进而调控肿瘤细胞的生长、增殖，促进血管生成，提高肿瘤细胞的侵袭、转移能力[18-19]。PI3K/AKT通路抑制剂LY294002为一种高效的AKT激酶选择性抑制剂，可使吉非替尼耐药的非小细胞肺癌细胞株逆转耐药 [20]。本研究利用加入PI3K/AKT通路激活剂和抑制剂的细胞通过RH123外排的检测来明确ABCG2外排情况。研究结果提示，IGF-1作用的 A549细胞，p-AKT、ABCG2蛋白表达均提高（P＜0.05）。 LY294002作用A549/GR细胞，p-AKT、ABCG2均下调（P＜0.05）。IGF-1作用 A549细胞后，较未加入激活剂的A549细胞，其外排作用增强（P＜0.05）。LY294002 作用 A549/GR 细胞后，较未加入激活剂的A549/GR细胞，其外排作用减少（P＜0.05）。提示PI3K/AKT激活剂和抑制剂可以调节Rh123的外排，故PI3K/AKT通路可能调节ABCG2的表达，与既往研究一致。

有报道[21-22]提示肺癌干细胞中ABCG2高表达，并与肺癌的耐药相关。另外一项研究结果提示[23]，手术前后NSCLC患者的ABCG2的表达，可见未手术的NSCLC患者血清中ABCG2的表达高于健康人及术后患者。本研究结果提示，健康人的ABCG2表达明显低于NSCLC非耐药组患者（P＜0.05），NSCLC吉非替尼耐药组患者的ABCG2表达均高于NSCLC非耐药组患者及健康人（P＜0.05）。证实ABCG2在NSCLC中要高于健康人群，吉非替尼耐药的NSCLC的表达高于NSCLC的人群。由此研究可见，ABCG2可作为吉非替尼耐药NSCLC的重要标记，对于预测耐药及指导后续耐药后治疗至关重要。

综上所述，ABCG2在NSCLC吉非替尼耐药中起到了重要的作用，本实验验证了ABCG2可作为预测EGFR-TKI耐药的重要指标，并证明了逆转ABCG2介导的NSCLC靶向耐药主要通过调节PI3K/AKT信号通路，后在NSCLC的患者中验证了这一推测，但本研究仍然具有一定的局限性，并没有行亚组及ABCG2与非小细胞肺癌患者治疗疗效及生存期的分析，值得进一步的探讨，为吉非替尼耐药的NSCLC治疗提供依据。

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