王媛媛1曹 建2▲邓 莉3

1.江西省南昌市第三医院心内科，江西南昌 330009；2.南昌大学第二附属医院麻醉科，江西南昌 330006；3.江西省南昌市第三医院科教科，江西南昌 330009

[摘要]目的探讨TOLL样受体3（TLR3）在大鼠心肌缺血/再灌注（I/R）损伤中的表达及作用机制。方法制备TLR3基因敲除大鼠及野生型大鼠，采用球囊结扎冠脉方法制作心肌缺血/再灌注动物模型，将60只大鼠随机分为假手术组（野生型）（n=15）、缺血/再灌注组（野生型）（n=15）、假手术组（TLR3－/－）（n=15）、缺血/再灌注组（TLR3－/－）（n= 15）。检测各组大鼠的心肌组织MDA、GSH、CK－MB、LVESV、LVEDV、LVEF及TLR3、NF－κB表达。结果缺血/再灌注组 （TLR3－/－）的MDA[（9.72±6.15）nmol/L]、CK－MB含量 [（1075.76±3.27）U/L]低于缺血/再灌注组 （野生型）[（14.85±5.2）nmol/L，（1842.16±4.28）U/L]，GSH含量[（152.46±2.82）mg/L]高于缺血/再灌注组（野生型）[（128.72± 1.82）mg/L]，差异有统计学意义（P＜0.05）。缺血/再灌注组（TLR3－/－）组的LVEDV[（602.0±2.7）μl]、LVESV[（516.0± 2.9）μl]低于缺血/再灌注组（野生型）[（702.0±4.5）、（516.0±2.9）μl]，LVEF[（42.0±2.8）%]高于缺血/再灌注组（野生型）[（36.0±4.2）%]，差异有统计学意义（P＜0.05）。缺血/再灌注组（野生型）TLR3（0.862±0.158）、NF－κB（0.786± 1.784）蛋白表达均高于假手术组（野生型）（0.315±1.834，0.206±1.924），差异有统计学意义（P＜0.05）。缺血/再灌注组（TLR3－/－）的TLR3蛋白（0.076±1.52）及NF－κB表达（0.625±2.824）低于缺血/再灌注组（野生型），差异有统计学意义（P＜0.05）。结论TOLL3受体基因缺失在心肌缺血损伤中具有心脏保护作用，其保护机制与减轻NF－κB，减轻心肌缺血/再灌注炎症反应有关。

世界卫生组织报道2008年全世界死于冠心病的人数占全部死亡人数的12.8%。心肌缺血/再灌注治疗在在恢复心肌供血及供氧的同时，同时会出现心肌超微结构、功能及代谢的损伤，甚至会引起明显炎症反应，出现缺血/再灌注损伤，早期对缺血/再灌注损伤进行干预治疗，是提高预后的关键[1－3]。Toll样受体 3（Toll－like receptor 3，TLR3）是生物体重要的病原体模式识别信号分子，其介导的炎症反应在缺血/再灌注过程中发挥重要作用，目前TLR3在心肌缺血/再灌注损伤中的作用机制尚未阐明，本实验通过制备TLR3基因敲除大鼠，并制备缺血/再灌注模型，来观察TLR3基因敲除后对大鼠的心肌保护作用及可能作用机制。

1.1.1 动物 TLR3基因敲除大鼠[许可证号SCXM（赣）2014－0012]30只，8周龄，雌雄各半，由北京大学医学部实验动物科学部提供。野生型SD大鼠30只，由南昌大学实验动物中心提供。本研究已经通过南昌大学医学院动物伦理委员会审查。

1.1.2 试剂 肌酸激酶同工酶（CK－MB）监测试剂盒（武汉亚法生物制品有限公司）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA），兔抗小鼠辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国Sigma公司，小鼠抗Akt单克隆抗体、TLR3抗体、NF－κB抗体购自美国Santa Cruz公司，蛋白浓度测定标准品购自普利莱公司。

实验动物分为4组，分别为假手术组（野生型）（n= 15）、缺血/再灌注组（野生型）（n=15）、假手术组（TLR3－/－）（n=15）及缺血/再灌注组（TLR3－/－）（n=15）。制作大鼠缺血/再灌注模型，实验前禁食12 h，10%水合氯醛麻醉（3.5 ml/kg）大鼠，仰卧位固定，气管插管，接人工呼吸机（呼吸频率：70次/min，潮气量：20 ml，呼吸时比1∶1）。开胸结扎冠脉左前降支，胸骨左侧2 mm切开皮肤，钝性分离肌肉见肋骨，在三四肋间，用拉钩拉开胸壁，小心剪开心包膜，在左心耳下缘3～4 mm进针，进针深约1.5 mm，斜向右上方肺动脉圆锥方向进针，针距约3～4 mm。稳定1 min后，收紧结扎线，30 min后轻拉松结线，扩开血管再灌注，缝合[4]。假手术组仅分离前室间支，不结扎[4]。假手术组（野生型）丝线穿过冠状动脉但左室支但不结扎，通过尾静脉注射生理盐水；缺血/再灌注组（野生型）制作大鼠缺血/再灌注模型；假手术组（TLR3－/－）丝线穿过冠状动脉但左室支但不结扎，通过尾静脉注射生理盐水；缺血/再灌注组（TLR3－/－）选取TLR3基因敲除大鼠制作大鼠缺血/再灌注模型。

1.3.1 生化指标的检测 各试验组大鼠缺血/再灌注2 h后，从腹主动脉采血5 ml，静置30 min，离心10 min（4℃，3000 r/min），进行血清分离，按照试剂盒说明测定MDA、GSH、CK－MB含量。

1.3.2 大鼠左心室收缩期末期容积、舒张末期容积、射血分数的测定 实验大鼠经过冠脉套扎术后8周，通过超声心动图测左心室收缩末期容积（LVESV）、左心室舒张末期容积（LVEDV）、左心室射血分数（LVEF）。选取异氟烷进行轻度全麻，使用12 MHz探头，从胸骨旁长轴短轴和四个腔室定位获得二维心室图，通过Modified Simpson Rule测量LVESV及LVEDV，LVEF=（LVEDV－LVESV）/LVEDV×100%，同一观察对象采用双盲法测量所有测量值，所有测量结果连续测5次取平均值。

1.3.3 Western blot法检测TLR3、NF-κB蛋白表达 制模结束后处死手术处理后的存活大鼠，按试剂盒说明书步骤提取总蛋白，碾磨心肌组织，BCA法蛋白进行蛋白定量，SDS－PAGE分离样品后转膜，常温下TBST封闭过夜，加入一抗后室温下免疫沉淀1 h，再加入兔抗小鼠辣根过氧化物酶标记的二抗2 h，显影，定影，扫描。

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

缺血/再灌注组（TLR3－/－）的MDA、CK－MB含量低于缺血/再灌注组（野生型），GSH含量高于缺血/再灌注组（野生型），差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

缺血/再灌注组（TLR3－/－）组的LVEDV、LVESV低于缺血/再灌注组（野生型），LVEF高于缺血/再灌注组（野生型），差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

缺血/再灌注组（野生型）TLR3、NF－κB蛋白表达均高于假手术组（野生型），差异有统计学意义（P＜0.05）。缺血/再灌注组（TLR3－/－）的TLR3蛋白及NF－κB表达低于缺血/再灌注组（野生型），差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

心肌缺血/再灌注损伤常发生于急性心肌梗塞溶栓术、体外循环心内直视手术及冠脉内球囊扩张血管成形术等过程中。其机理复杂，目前认为与再灌注后氧自由基大量生成、细胞内钙超载、微血管内皮细胞损伤及血管内皮细胞与血小板聚集粘附有关。改善缺血区心肌细胞正常功能，是目前心肌缺血/再灌注研究的重要方面[5－7]。

Toll样受体家族蛋白分为细胞外区和细胞内区，内区与白细胞介素－1受体结构相似的信号传导结构域组成，能识别侵入体内异物，不仅激活固有免疫应答，还可以激活适应性免疫应答，启动下游的信号通路，通过募集中性粒细胞、吞噬细胞诱导炎症反应，释放大量的炎症因子（如各种白介素因子）介导炎症的产生[8－12]。人类TLR3由904个氨基酸组成，其相对分子量约为125 KU，可以识别病毒来源的双链RNA，激活NF－κB及干扰素调节因子，引起炎性细胞因子的释放。近年有研究发现，TLR3在人动脉粥样硬化组织起源的平滑肌细胞上的表达上调，可引起许多趋化因子和炎性细胞因子表达增加，这些因子均具有促动脉粥样硬化作用。

本实验通过TLR3基因敲除大鼠及野生型大鼠制作缺血/再灌注模型。缺血/再灌注组（TLR3－/－）反映氧化损伤的MDA含量低于缺血/再灌注组 （野生型），反映心肌细胞缺血受损的CK－MB含量降低，GSH含量升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。缺血/再灌注组（TLR3－/－）的LVEDV、LVESV低于缺血/再灌注组（野生型），LVEF高于缺血/再灌注组（野生型），差异有统计学意义（P＜0.05）。提示TLR3基因敲除后，可以延缓心室重构，改善心功能。实验结果提示缺血/再灌注可以刺激TLR3表达，进一步激活NF－κB，引起心肌炎症反应，加重缺血/再灌注损伤，而在TLR3基因敲除组大鼠，可以通过减少TLR3蛋白及NF－κB表达减轻炎症反应，对缺血/再灌注心肌起到保护作用。同时有研究发现TLR3可诱导血管活性氧产生增加，可引起血管舒张功能受损、再内皮化减少加剧，内皮细胞功能受损[13－15]。

综上所述，TLR3在心肌缺血/再灌注的发展过程中起着保护作用，但其确切的机制尚未完全明确，需要进一步明确，为治疗心肌缺血/再灌注损伤提供新的治疗靶点。

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Mechanism of Toll-like receptors 3 on heart ischemia/reperfusion injury in rats

WANG Yuan-yuan1CAO Jian2▲ DENG Li3
1.Department of Cardiology,the third hospital of Nanchang,Jiangxi Province,Nanchang 330009,China;2.Department of Anesthesiology,the Second Affiliated Hospital of Nanchang University,Jiangxi Province,Nanchang 330006,China;3.Science and Education Section,the third hospital of Nanchang,Jiangxi Province,Nanchang 330009,China

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expression of Toll－like receptors 3 and the correlation mechanism of ischemia/ reperfusioninjuryinrats.MethodsTOLL－likereceptor3deficient(TLR3－/－)andwildtype(WT)ratsweresubjected to ischemia/ reperfusion induced by ligation of the left anterior descending coronary artery.Sixty rats were divided into 4 groups: sham－operated group(WT)(n=15),myocardial ischemia/reperfusion group(WT)(n=15),sham－operated group(TLR3－/－) (n=15)and myocardial ischemia/reperfusion group(TLR3－/－)(n=15).The MDA,GSH,CK－MB,LVEDV,LVESV,LVEF and the expression of TLR3,NF－κB in four groups were detecte.ResultsThe level of MDA [(9.72±6.15)nmol/L],CK－MB [(1075.76±3.27)U/L]in myocardial ischemia/reperfusion group(TLR3－/－)were lower than the myocardial ischemia/reperfusion group(WT)[(14.85±5.2)nmol/L，(1842.16±4.28)U/L],the value of GSH in myocardial ischemia/reperfusion group(TLR3－/－)was higher than the myocardial ischemia/reperfusion group(WT),and the differences were statistically significant(P＜0.05).The LVEDV [(602.0±2.7)μl],LVESV [(516.0±2.9)μl]of the myocardial ischemia/reperfusion group (TLR3－/－)were lower than the myocardial ischemia/reperfusion group(WT)[(702.0±4.5)μl,(516.0±2.9)μl],the LVEF[(42.0±2.8)%]of the myocardial ischemia/reperfusion group (TLR3－/－)was higher than the myocardial ischemia/reperfusion group(WT) [(36.0±4.2)%],and the differences were statistically significant(P＜0.05).The expression of TLR3(0.862±0.158), NF－κB(0.786±1.784)of the myocardial ischemia/reperfusion group(WT)were higher than the sham－operated group(WT) (0.315±1.834,0.206±1.924),and the differences were statistically significant(P＜0.05).The expression of TLR3(0.076± 1.52)、NF－κB (0.625±2.824)of the myocardial ischemia/reperfusion group (TLR3－/－)were lower than the myocardial ischemia/reperfusion group(WT),and the differences were statistically significant(P＜0.05).Conclusion The TLR3 deficient is important to reduce myocardial I/R injury,it is related to suppress the inflammatory response by down－regulation of NF－κB signaling pathway.

[Key words]Toll－like receptors 3;Myocardial ischemia/reperfusion;NF－κB

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）11（a）-0004-04

（收稿日期：2017-08-30 本文编辑：孟庆卿）