复合氨基酸-铁、锌、铜配合物的合成及其抗肿瘤抗菌生物活性研究
吴 菁
南昌市第一医院药剂科，江西南昌 330008
[摘要]目的 将铁、铜、锌与复合氨基酸反应生成配合物，并研究三种配合物的抗肿瘤抗菌作用。方法 采用MTT法测定复合氨基酸及其配合物对A549、HepG2的IC50；采用倍比稀释考察配合物对沙门菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑制作用。结果 复合氨基酸、铁配合物、锌配合物、铜配合物对A549的IC50分别为268.6、200.9、193.7、162.8 μmol/L，对 HepG2 的 IC50分别为 183.8、132.3、136.8、98.5 μmol/L；对沙门菌的 MIC 分别为 1.00、0.50、0.50、0.50 mg/ml，对金黄色葡萄球菌的MIC分别为0.50、0.25、0.25、0.25 mg/ml，对大肠埃希菌的MIC分别为1.00、0.50、0.50、0.50 mg/ml。结论 三种配合物抗菌抗肿瘤活性均优于复合氨基酸。
[关键词]复合氨基酸；铁；铜；配合物；抗肿瘤；抗菌
[中图分类号]R978.1
[文献标识码]A
[文章编号]1674-4721（2018）10（c）-0030-03
[基金项目]江西省南昌市指导性科技计划项目
[作者简介]吴菁（1967-），女，汉，江西南昌人，主管药师，本科，研究方向：西药类
Synthesis of compound amino acid iron,zinc and copper complexes and their antitumor and the study on the antibacterial activities
WU Jing
Department of Pharmacy,the First Hospital of Nanchang,Jiangxi Province,Nanchang 330008,China
Department of Pharmacy,the First Hospital of Nanchang,Jiangxi Province,Nanchang 330008,China
[Abstract]Objective To prepare complexes of iron,copper and zinc with complex amino acids,and to study the antitumor and antibacterial effects of the three complexes.Methods The MTT method was used to determine the IC50of the complex amino acids and their complexes on A549and HepG2,and the inhibitory effects of the complexes on Salmonella,Staphylococcus aureus and Escherichia coli were investigated by double dilution.Results The IC50of A549were 268.6,200.9,193.7 and 162.8 μmol/L respectively,and IC50for HepG2 were 183.8,132.3,136.8 and 98.5 μmol/L respectively.The MIC of Salmonella were 1.00,0.50,0.50,0.50 mg/ml respectively,and MIC for Staphylococcus aureus were 0.50,0.25,0.25 and 0.25 mg/ml respectively,and the MIC of Escherichia coli were 1.00,0.50,0.50 and 0.50 mg/ml respectively.Conclusion The antibacterial and antitumor activities of the three complexes are better than that of the compound amino acids.
[Key words]Compound amino acids;Iron;Copper;Complexes;Anti-tumor;Antibacterial
复合氨基酸是人体生命运动中所必须的基本物质，具有增强人体免疫功能、加强营养吸收的作用，能够缓解身体和精神的疲劳，能够改善肝肾功能以及增加记忆力等。有关研究报道，化合物与金属元素，特别是人体必需微量元素，发生配合反应时，其活性会显著增加[1-7]。铁、锌、铜都是人体必需的微量元素，对人体的生理功能具有促进作用。本研究将复合氨基酸和铁、锌、铜三种人体必需微量元素进行配位化学反应，并研究其抗肿瘤抗菌作用，以期获得活性更强的药物，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
复合氨基酸（苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、胱氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、天门冬氨酸、苏氨酸、色氨酸、丝氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、脯氨酸）（购于深圳市万和制药有限公司，生产批号H20000478，纯度>99%，相对分子质量为 126）；Fe2（SO4）3（分析纯）；ZnSO4·7H2O（分析纯）；CuSO4·5H2O（分析纯）；氢氧化钠（分析纯）；96 孔培养板（美国Costar公司）；健康昆明小鼠[体重（22±2）g，重庆医科大学实验动物中心购买，证号SCXK（渝）2007-0001]；超净工作台（苏州净化设备厂）；85-1恒温磁力搅拌器（常州国华电器有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 复合氨基酸铁、锌、铜配合物的合成 称取30 g复合氨基酸，加入纯水，搅拌并过滤去掉不溶解的成分，平行制备3份溶液。分别称取硫酸铁、硫酸锌、硫酸铜与氢氧化钠反应，得氢氧化铁、氢氧化锌、氢氧化铜沉淀，分别将3种沉淀加入配置好的复合氨基酸溶液中，分别按复合氨基酸:金属离子（摩尔比）=2:1进行反应，设定温度在60℃左右，再进行水浴加热，逐渐加热至80℃，不断滴加氢氧化钠溶液，反应6～12 h，过滤，除去未反应不溶物质，得深蓝色滤液，加丙酮溶液立即沉淀，60℃烘干，得蓝色固体产物。
1.2.2 复方氨基酸、复合氨基酸铁、锌、铜配合物小鼠急性毒性实验 将复合氨基酸铁、锌、铜配合物、复方氨基酸溶于纯水，配置为60%的溶液，按文献要求的最大耐受剂量法[8]对每只小鼠进行灌胃给药，给药量为5 g/kg，并观察两周，记录小鼠的生存情况。
1.2.3 复合氨基酸铁、锌、铜配合物的体外抗肿瘤实验方法 将肿瘤细胞（A549、HepG2），用含胚牛血清（浓度为10%）的RPMI-1640培养基配置成细胞浓度为1×104个/ml。将上述细胞接种在96孔板中，每个孔加入的量为 100 μl，放置在温度 37℃、5%CO2培养箱中进行培养，培养的时间为24 h。吸出并更换培养基后，加入 5 个浓度（20、40、80、160、320 μmol/L）的复合氨基酸、复合氨基酸铁、锌、铜配合物，每孔 100 μl，每个浓度设5个复孔，空白组只加培养基。之后继续放置在培养箱中培养，培养时间为48 h，再在每个孔中加入MTT培养，培养时间为4 h，培养后弃上清液，再加入DMSO，振荡，将96孔板放置在在酶标仪中，于570 nm处测定吸光度。计算公式，抑制率=（1-实验组A值）/对照组A值×l00%，计算结果。
1.2.4 复合氨基酸铁、锌、铜配合物抗菌实验 采用微生物划线法将沙门菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌培养后，细菌配置的浓度为2×105个/ml，在96孔板中使用倍比稀释法稀释为 5个浓度（2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 mg/ml）的复合氨基酸铁、锌、铜配合物，上述每个浓度再设置5个复孔，再在每个孔中加入相等量浓度的菌液，细菌在37℃的培养箱中培养，培养时间为24 h，通过观察96孔板是否为透明，对应几种药物溶液浓度最小的透明的孔，该孔即为该药物的最小抑菌浓度MIC。
2 结果
2.1 复合氨基酸-铁、复合氨基酸-锌、复合氨基酸-铜配合物的产率
反应产物经烘干恒重后，称量产物重量，计算产率，结果见表1。
表1 复合氨基酸-铁、复合氨基酸-锌、复合氨基酸-铜配合物的产率
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2.2 三种金属配合物中铁、锌、铜的配位比及金属含量
为确定复合氨基酸铁、锌、铜三种金属配合物的化学结构，即复合氨基酸与铁、锌、铜三种金属的配位比，采用EDTA滴定法测定所得产物中铁、锌、铜的含量，结果见表2。
表2 三种金属配合物中铁、锌、铜的配位比及金属含量
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2.3 急性毒性实验结果
复方氨基酸及复合氨基酸-铁、复合氨基酸-锌、复合氨基酸-铜配合物灌胃给药后，所有小白鼠的活动虽然会稍微减弱，但均能快速地恢复正常，无论是呼吸、食量还是其他各项活动均显示为正常，没有出现中毒的症状。连续给药2周，所有小鼠都没有死亡，并且未出现任何中毒的症状，提示复合氨基酸及铁、锌、铜等3种配合物对小鼠灌胃给药的急性毒性（LD50）＞5000 mg/kg。 根据 LD50剂量分级，三种金属配合物经口给药都属于实际无毒范围。
2.4 抗肿瘤作用结果
采用MTT法测定复合氨基酸及其三种金属配合物对 A549、HepG2 的 IC50，结果见表 3。
表3 复合氨基酸及复合氨基酸-铁、锌、铜配合物的IC50值（μmol/L）
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2.5 抗菌作用结果
采用倍比稀释方法考察复合氨基酸及其三种金属配合物对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑制作用，结果见表4。
表4 复合氨基酸及复合氨基酸-铁、锌、铜配合物的MIC值（mg/ml）
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3 讨论
复合氨基酸有些为人体所必须的氨基酸，而铁、锌、铜虽然也是人体必需微量元素，但服用过量也有一定毒性，文献报道，有机化合物与金属离子发生配合反应生成配合物后毒性会降低[9-10]，这与本研究急性毒性实验结果一致，复合氨基酸-铁配合物、复合氨基酸-锌配合物、复合氨基酸-铜配合物三种金属配合物对小鼠均无毒，原因有可能是无机金属离子过量本身是有毒性的，但是经过与有机物反应后，金属键转变为配位共价键，金属离子的毒性消失或降低。复合氨基酸与铁、锌、铜三种金属的配位比均为2:1，推测是氨基酸的氨基和羧基与金属离子发生了配位反应，因氨基和羧基均有孤对电子，可将电子提供给缺电子的正价金属离子。
另外，实验合成的3种复合氨基酸金属配合物，抗肿瘤抗菌作用均强于复合氨基酸，表明复合氨基酸与金属离子反应生成配合物后，其生物活性显著增强，因为很多氨基酸和金属离子本身具有抗菌抗肿瘤的作用，而将二者通过化学方法合成新的产物，可能发挥了氨基酸和金属离子的协同作用，因此生物活性增强，可见，复合氨基酸金属配合物显示出较大的药用开发价值，有必要进一步深入研究。
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收稿日期：2018-06-04
本文编辑：孟庆卿