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肝内胆管癌属于恶性肿瘤，患者的肝内胆管上皮细胞先发生病变，逐步侵袭、转移，给患者带来巨大的痛苦，甚至威胁患者生命[1]。相关报道显示，近年来肝内胆管癌的发生率在世界范围内出现增长形式，且死亡率也明显升高[2-3]。有文献指出，上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是引发癌细胞向局部浸润以及转移的重要因素之一[4-5]。Snail基因的表达产物是一种在上皮间充质转分化过程中居于重要地位的转录因子。EMT是包括非小细胞肺癌在内的多种肿瘤细胞获得侵袭转移能力的重要机制[6-7]。本研究旨在探讨Snail蛋白在肝内胆管癌患者中的表达及其意义，为临床诊治肝内胆管癌提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年3月～2016年2月在运城市中心医院就诊的72例肝内胆管癌患者，其中男37例，女35例；年龄≥65岁21例，年龄＜65岁51例；血清癌胚抗原（CEA）≥5 ng/ml 52例，＜5 ng/ml 20例；肿瘤标志物血清 CA19-9≥37 ng/ml 39 例，CA19-9＜37 ng/ml 33例；TNM分期≤Ⅱ期42例，Ⅲ或Ⅳ期30例。所有患者均符合以下标准：①均进行相应根治性切除手术；②手术前未接受放疗、化疗等治疗；③无心、肺等重要器官性疾病；④患者及其家属均同意参与研究，并签署知情同意书。本研究已获得医院医学伦理委员会的批准。对所有患者进行随访，随访截止到2017年6月，无一例患者失访，平均随访时间为（18.21±13.11）个月。

1.2 检测方法

先制作切片，将获得的患者组织用4%的多聚甲醛进行固定，脱去水分，石蜡包埋，组织切成薄片制片备用。将切片在90℃烘烤2 h。然后将其浸泡在二甲苯溶液中15 min，再重复进行1次。之后按顺序分别放入浓度为100%、95%、90%、75%、70%的乙醇溶液中浸泡5 min。在100℃下使用浓度为10 mmol/L的柠檬酸钠进行抗原修复，持续进行10 min后，放置室温下30 min使其温度降低。向切片滴加3%过氧化氢保持20 min，阻止内源性过氧化物酶发挥作用。每张切片滴加非免疫动物血清（5%牛血清蛋白），封存2 h。向切片滴加1∶500的一抗兔抗Snail单克隆抗体，进行孵育，4℃过夜。往切片滴入山羊抗兔二抗，进行孵育20 min，DAB显色，在显微镜观察下加入苏木精进行复染，出现水化作用及透明变化，封固保存切片。使用显微镜进行检查，并将观察到的数据记录下来。

1.3 观察指标

①癌组织及癌旁组织Snail蛋白的表达情况：评分标准与复旦大学中山医院肝癌研究所制定标准[8]一致，由染色面积和强度两项组成。当染成棕色的面积超过一半时记1分，否则记0分；当未被染色时记0分，染色较浅记1分，颜色呈棕黑时记2分。两项得分相加，分数≥2分为Snail蛋白高表达，分数＜2分则是Snail蛋白低表达。高表达率=高表达例数/总例数×100%。②临床病理因素：包括性别、年龄、血清CEA、肿瘤标志物血清CA19-9、TNM分期、微血管是否侵犯及有无复发。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（

±s）表示，采用 t检验，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 .结果

2.1 患者癌组织及癌旁组织Snail蛋白表达情况的比较

癌组织的免疫组化评分明显高于癌旁组织（P＜0.05）；癌组织的Snail蛋白高表达率明显高于癌旁组织（P＜0.05）（表 1）。

表1 患者癌组织及癌旁组织Snail蛋白表达情况的比较

2.2 Snail蛋白表达与临床病理因素的关系

不同表达的Snail蛋白之间的性别、年龄、血清CEA、肿瘤标志物血清CA19-9比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；不同表达的Snail蛋之间的TNM分期、微血管是否侵犯及有无复发比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 2）。

表2 Snail蛋白的表达与临床病理因素的关系[n（%）]

2.3 多因素分析患者总存活率及总复发率情况

多因素分析显示，不同TNM分期的总存活率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；微血管是否侵犯及Snail蛋白的高表达或低表达的总存活率及总复发率差异有统计学意义（P＜0.05）（表 3）。

表3 多因素分析患者总存活率及总复发率情况

3 讨论

肝内胆管恶性肿瘤具有较强的侵袭能力，容易引起患者死亡，这给医学工作者的治疗工作带来了挑战，需要寻找准确有效的因子对肝内胆管癌的预后进行分析。EMT是恶性肿瘤发展的重要机制，其在肝内胆管癌这一恶性肿瘤的侵袭中也发挥了重要作用[9-10]。Snail蛋白是EMT发展中协助转录的重要蛋白因子，能够抑制上皮细胞E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达，诱发细胞产生EMT[11-12]。本研究采用免疫组织化学方法，对肝内胆管癌患者癌组织及癌旁组织标本中Snail蛋白的表达情况进行了检测，旨在寻找肝内胆管癌患者预后评价的有效标志物。

本研究结果显示，癌组织的免疫组化评分明显高于癌旁组织（P＜0.05）；癌组织的Snail蛋白高表达率明显高于癌旁组织（P＜0.05）。可能原因是在肿瘤组织中，Snail蛋白的表达更多，进一步提示Snail蛋白的表达与癌组织的转移等有关[13-14]。Snail蛋白的表达与性别、年龄、癌胚抗原血清CEA、肿瘤标志物血清CA19-9 之间无明显差异（P＞0.05）；Snail蛋白的表达与TNM分期、微血管是否侵犯及有无复发，存在明显差异（P＜0.05），提示Snail蛋白的表达与肝内胆管癌的侵袭、转移、复发有关，这与周博鑫等[15-16]的研究结果一致。其可能通过作用于肝内胆管上皮细胞，使细胞表型等方面发生改变，促使其发生EMT，进而导致肝内胆管癌进一步侵袭[17-18]，这也提示可以从转录因子Snail蛋白方面入手，寻找减弱癌细胞转移能力的方法，抑制肿瘤细胞的侵袭，从而减轻患者痛苦，为患者带来希望[19]。

本研究结果还显示，TNM分期对总存活率的差异无统计学意义（P＞0.05）；微血管是否侵犯及Snail蛋白的高表达或低表达的总存活率及总复发率差异有统计学意义（P＜0.05）。对肝内胆管癌患者进行免疫组织化学检测，能够为临床工作提供有效的依据，且对于减少患者术后复发情况的发生及提高患者存活率有着重要的意义[20]。

综上所述，免疫组织化学检测肝内胆管癌患者癌组织中Snail蛋白的表达要高于癌旁组织，并且Snail蛋白的表达与肝内胆管癌的侵袭、转移、复发有关，可以作为评价肝内胆管癌患者预后的指标。

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