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稽留流产是妊娠20周内胚胎或胎儿已死亡而未排出母体[1]。发生原因多种多样，包括遗传、感染、环境、免疫等因素[2-3],但具体机制不详。一些研究越来越重视感染及细胞凋亡因素，其可能是导致流产发生的重要因素。多项研究也证实了Toll样受体4（TLR4）、核转录因子-kappaB（NF-κB）与感染及细胞凋亡密切相关。TLR4、NF-κB通过各种机制参与自然流产的发生及发展，但两者与稽留流产的相关研究甚少。本研究采用免疫组化法检测TLR4、NF-κB稽留流产患者绒毛及蜕膜组织中的表达，探讨两者与稽留流产的关系，为进一步探讨稽留流产的发病机制提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年1月～2017年10月在惠州市第三人民医院妇科收治的90例稽留流产患者作为实验组，其中50例稽留流产伴感染者作为A组，40例稽留流产伴不伴感染者作为B组。A组年龄20～35岁，平均（26.3±2.4）岁；孕龄 7～12 周，平均（9.5±1.5）周；B组年龄 20～36 岁，平均（26.3±2.5）岁；孕龄 7～13 周，平均（9.6±1.5）周。选取同期无合并症并要求行人工流产的50例早孕妇女作为对照组（C组），年龄23～35岁，平均（27.1±2.5）岁；孕龄 6～10 周，平均（7.5±1.5）周。三组的一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。各组夫妻双方染色体核型正常，男方精液正常，实验组既往无自然流产、死胎、死产史，无免疫系统异常，无产道异常及遗传病史，平素月经周期规律，在流产前无用药史。本研究经医院医学伦理委员会批准，参与研究者均签署知情同意书。稽留流产诊断标准以人民卫生出版社第8版《妇产科学》为主。

1.2 方法

1.2.1 标本来源所有病例经负压吸引术后取其绒毛及蜕膜组织，用0.9%生活盐水冲洗干净，用4%多聚甲醛固定后送病理科常规包埋石蜡切片。

1.2.2 免疫组织化学 SP法检测使用的兔抗人TLR4抗体、鼠抗人NF-κB抗体及通用型免疫组化试剂盒均购于北京中杉生物科技公司。按照试剂说明书进行操作。

1.3 观察指标与评价标准

1.3.1 HE结果判读显微镜下观察绒毛组织无水肿，滋养细胞无明显增生。

1.3.2 免疫组化染色片的阅读以细胞胞膜或胞质中出现棕黄色颗粒，其着色强度高于非特异性背景者为判断阳性。根据染色深浅及阳性细胞数百分比进行处理。染色深浅评分标准：细胞无显色或显色不清为0分，细胞呈浅黄色为1分，细胞呈棕黄色为2分，细胞呈棕褐色为3分；阳性细胞数百分比评分标准：＜10%为 0分，10%～50%为 2分，＞50%～80%为 3分，＞80%为4分。将上述两项评分相加0～1分定为阴性（-）；2～3 分为阳性（+）；4～5 分为中等阳性（++）；6～7分为强阳性（+++）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析,采用χ2检验、Fishem确切概率法检验及Spearman等级相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TLR4、NF-κB在绒毛和蜕膜组织的表达

A、B组及C组的绒毛及蜕膜组织中均可见TLR4、NF-κB表达。其中绒毛组织中TLR4主要表达在细胞滋养细胞及合体滋养细胞细胞的胞质和胞膜中，在蜕膜组织中表达于腺体上皮细胞的胞质和胞膜。NF-κB在绒毛的合体滋养细胞、毛细血管内皮细胞的胞浆中，蜕膜组织主要表达在腺体上皮细胞的胞质中。 A、B组与 C组比较，TLR4、NF-κB在 A、B组的绒毛及蜕膜组织中表达均增高（表1）；与B组比较，TLR4在A组的绒毛及蜕膜组织中表达明显增高，差异有统计学意义（表2）。

表1 TLR4、NF-κB在三组绒毛组织的表达情况的比较[n（%）]

表2 TLR4在A、B组绒毛组织中表达情况的比较（例）

2.2 相关性分析

经Spearman等级相关分析显示，A组的TLR4及NF-κB在绒毛及蜕膜组织中表达成正相关（r=0.527，χ2=9.56，P＜0.05）（表3）。

表3 A组的TLR4、NF-κB表达的相关性（例）

3 讨论

3.1 TLR4与稽留流产的相关性

TLR4广泛分布在人体组织中，其与相应的配体结合后，通过各种信号传导通路激活细胞内级联反应，促进机体的天然免疫应答以及多种炎性细胞因子的基因表达。低浓度的TNF-α可以维持妊娠正常进行，而高浓度的TNF-α可通过以下机制导致流产发生：①促进前列腺素E的合成，进而兴奋子宫平滑肌；②促进胚胎滋养细胞大量凋亡；③激发Thl型免疫反应，排斥胚胎组织。TLR4与流产关系密切，张月莲等[5]研究显示，复发性流产的发生与外周血淋巴细胞、绒毛及蜕膜组织中TLR4高表达密切相关,提示对早孕女性进行外周血TLR4的监测,有利于预测流产发生的风险。Friebe等[6]在研究自然流产模型鼠中发现,通过加入某些因素使TLR4的异常表达，激活了TLR4信号转导通路，导致大量炎性因子释放，使母胎之间产生了较强的免疫排斥反应，最终导致流产的发生，而阻断TLR4信号通路，能够减少胎鼠的丢失，进而减少流产发生。本研究结果显示，在稽留流产患者及正常早孕女性的绒毛滋养细胞及蜕膜组织中均有TLR4表达，但TLR4在稽留流产组表达强度明显高于C组，两者差异有统计学意义（P<0.05）；且稽留流产患者中伴有炎症细胞较多的绒毛组织中的TLR4表达强度明显高于C组，提示TLR4与人类胚胎发育关系也较为密切；绒毛及蜕膜组织中TLR4的正常表达维持着正常妊娠过程；某些因素导致妊娠女性胚胎中绒毛及蜕膜组织中的TLR4表达增高，而高浓度的TLR4可能通过上述机制使胚胎滋养细胞发生炎症反应或细胞凋亡，继而使胚胎发育停止，导致稽留流产发生。

3.2 NF-κB与稽留流产的相关性

NF-κB在机体多种组织细胞中均有表达，其激活后对细胞增殖、氧化应激、细胞凋亡及炎症反应等过程中发挥着重要作用。如在感染性疾病和自身免疫性疾病的发病机制中，NF-κB通过参与调节炎症过程中细胞黏附因子和某些细胞因子的表达可能发挥着重要作用[7]。研究显示，在妊娠女性子宫内膜及蜕膜组织中均有NF-κB少量表达，低浓度的NF-κB可参与早期胚胎的发育及着床过程，而NF-κB的表达上调可导致妊娠过程不能继续进行。高浓度的NF-κB参与流产发生的机制如下。①调节环氧合酶-2（COX-2）的合成和释放，后者诱导前列腺素的产生后兴奋子宫平滑肌，诱发子宫收缩；②引起胎盘滋养细胞过度凋亡，加剧母胎之间的排斥反应，间接诱发子宫收缩；③调节TNF-α的合成及释放：高浓度的TNF-α一方面通过提高体内前列腺素E的合成及激活凝血系统，兴奋子宫平滑肌，促使胎盘滋养血管内血栓形成，影响绒毛的正常发育；另一方面激发Thl型免疫反应，排斥胚胎组织导致流产；④调节孕酮的表达水平，使孕酮与不能与相应受体结合，不能抑制子宫收缩，继而不能继续维持妊娠[8]。多项研究显示NF-κB与流产关系密切[9-11]。本研究结果显示，在稽留流产组及正常早孕组的绒毛合体滋养细胞及蜕膜腺上皮细胞中均有NF-κB表达，但在稽留流产患者绒毛及蜕膜中的表达高于对照组，两者差异有统计学意义（P<0.05），提示绒毛中正常水平的NF-κB可能参与人类早期胚胎发育及着床过程，维持正常妊娠过程；某些因素导致绒毛中NF-κB表达增高后可能通过上述机制则使滋养细胞发生凋亡，继而胚胎发育停止，导致稽留流产。

3.3 TLR4-NF-KB信号转导通路与稽留流产的关系

研究发现，TLR是体内介导炎症反应重要的模式识别受体，能够识别多种病原微生物并启动下游信号通路，通过活化NF-κB来启动机体炎症介质的表达及激活局部组织的炎症反应[12]，故TLR4-NF-κB是与抗炎免疫机制密切相关的一条信号传导通路。TLR4信号转导主要通过MyD88依赖性途径来介导NF-κB及促炎细胞因子的产生而激发下游炎症反应。在细胞内TLR4与配体结合后募集MyD88，使MyD88与特异的接头蛋白发生桥接，使TLR4把信号传到细胞内，通过激活一系列酶促使NF-κB入核后使相关基因发生转录及翻译，炎性因子大量释放后参与炎症反应及组织器官的损伤[13]。多项研究显示TLR4-NF-κB信号转导通路在哮喘[14]、心肌梗死[15]、糖尿病[16]、肺炎支原体感染[17]、骨关节炎[18]、溃疡性结肠炎[19]等炎症性疾病中起着重要作用。炎症因素也是导致流产发生的原因之一。白雪等[20]发现 TLR4、NF-κB、p65 在复发性流产的绒毛组织中蛋白和mRNA表达水平有升高，推测TLR4-NF-κB信号传导通路可能与复发性流产发生密切相关。本研究显示，在同一稽留流产患者伴有炎症的绒毛及蜕膜组织中TLR4与NF-κB表达成正相关，故推测在早期妊娠过程中某些因素如激活了TLR4一NF-κB信号转导通路，导致体内某些炎性因子大量释放或细胞异常凋亡，导致稽留流产发生。

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