miR-92在上皮性卵巢癌组织中的表达及临床意义
胡 萍1 彭 蔚2 吴名桃1 刘 婷1
1.江西省萍乡市人民医院妇科，江西萍乡 337000；2.江西省萍乡市人民医院超声科，江西萍乡 337000
[摘要]目的 探讨miR-92在上皮性卵巢癌组织中的表达及临床意义。方法 选取2007年1月～2017年12月我院收治的300例各期上皮性卵巢癌患者、300例上皮性卵巢良性肿瘤患者以及300例因生殖器官（除卵巢外）良性病变而行单侧或双侧卵巢切除患者作为研究对象，采用实时荧光定量检测法检测三组患者术后卵巢癌癌组织、卵巢良性肿瘤组织及正常卵巢组织中miR-92的表达水平。结果卵巢癌组患者的miR-92水平高于卵巢良性肿瘤组及正常卵巢组，差异有统计学意义（P＜0.05）。卵巢癌组的miR-92水平与淋巴结转移、临床分期以及肿瘤分化程度有关（P＜0.05）。结论miR-92表达水平可作为上皮性卵巢癌的临床诊断依据。
[关键词]上皮性卵巢癌；miR-92水平；实时定量RT-PCR
[中图分类号]R737.31
[文献标识码]A
[文章编号]1674-4721（2018）10（b）-0055-03
Expression and clinical significance of miR-92 in epithelial ovarian cancer
HU Ping1PENG Wei2WU Ming-tao1LIU Ting1
1.Department of Gynecology,People′s Hospital of Pingxiang City in Jiangxi Province,Pingxiang 337000,China;2.Department of Ultrasound,People′s Hospital of Pingxiang City in Jiangxi Province,Pingxiang 337000,China
[Abstract]Objective To investigate the expression and clinical significance of miR-92 in epithelial ovarian cancer.Methods From January 2007 to December 2017,altogether 300 cases of patients with epithelial ovarian cancer,300 cases of benign ovarian tumor,and 300 patients who underwent unilateral or bilateral ovariectomy because of benign lesions of reproductive organs(except ovary)were selected as the research objects.The real-time fluorescence quantitative assay was used to detect the expression of miR-92 in ovarian cancer,benign ovarian tumor and normal ovarian tissues.Results The level of miR-92 in ovarian cancer group was higher than that in ovarian benign tumor group and normal ovarian group,and the difference was statistically significant(P＜0.05).The level of miR-92 in ovarian cancer group was related to lymph node metastasis,clinical stage and tumor differentiation (P＜0.05).Conclusion The level of miR-92 expression can be used as a clinical basis for the diagnosis of epithelial ovarian cancer.
[Key words]Epithelial ovarian cancer;miR-92 level;Real-time quantitative RT-PCR
上皮性卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤，具有隐匿性，临床早期诊断缺乏特异性指标和诊断方法，当疾病被确诊时大多数患者已经发展为癌症晚期，导致病死率较高[1]。随着医疗技术水平的逐步提高，通过对肿瘤标志物水平的诊断和检测，使上皮性卵巢癌的临床诊断率显著提高，但仍然受到一定的限制，因此选择更加具有特异性的诊断标志物对改善患者预后具有积极意义。近年来，有相关学者认为miRNA可以参与到细胞发育、凋亡、分化以及新陈代谢等多种病理生理过程，并且在肿瘤患者的肿瘤细胞中发现有大量miRNAs存在[2]。为此，本研究对上皮性卵巢癌患者组织中miR-92表达以及在卵巢癌发生及发展过程中所发挥的作用作如下研究分析。
1 资料与方法
1.1 一般资料
经我院医学伦理委员会的批准同意下，在我院2007年1 月～2017年12月收治的各期上皮性卵巢癌患者、上皮性卵巢良性肿瘤患者以及因生殖器官（除卵巢外）良性病变而行单侧或双侧卵巢切除患者中各随机选择300例分别作为卵巢癌组、良性卵巢肿瘤组与正常卵巢组。纳入标准：均签署书面知情同意书；年龄为18～80岁；卵巢癌组研究对象经病理检查明确患有卵巢癌，临床分期为Ⅰ～Ⅳ期；良性卵巢肿瘤组为同期于我院确诊为卵巢良性肿瘤的患者，且接受单侧或双侧手术治疗；正常卵巢组为同期于我院因生殖器官（除卵巢外）良性病变而行单侧或双侧卵巢切除的患者，未患有卵巢疾病。排除标准：患有卵巢交界性肿瘤者；伴有其他严重器质性恶性肿瘤的患者[3]。
1.2 方法
1.2.1 实验试剂与仪器 人卵巢癌细胞株SKVO3购自于上海拜力生物科技有限公司；正常卵巢组织、上皮性卵巢癌组织以及上皮性卵巢良性肿瘤组织均由萍乡市人民区医院病理科所提供；TM2000由美国Invitrogen公司提供；DMEM以及Opti-MEM无血清培养基均由Gibco公司所提供；转染用的脂质体由Lipofectamine提供；miR-92反义寡核苷酸以及对照核苷酸均由上海吉玛公司提供；细胞增殖检测试剂盒由广州市锐博生物科技有限公司提供；荧光素探针细胞凋亡检测试剂盒购自美国罗氏公司；实施定量PCR试剂由美国Ap-plied Biosystems提供。
1.2.2 提取样本总DNA 将保存的组织样本500 μl置于冰上解冻后，利用预冷的PBS液对标本进行洗涤，共洗涤2次，将样本放入研钵后加入1 ml Trizol后，进行充分的研磨，提取总RNA。之后对OD280以及OD260的吸光度值进行检测，并测定RNA的浓度以及质量[4]。
1.2.3 合成cDNA 取0.5 μg吸光度比值为1.8～2.1的RNA进行逆转录反应，分别加入焦炭酸二乙酯水以及miR-92逆转录引物，总体积保持在13 μl。在25℃条件下，共持续反应5 min，并将其置于冰上2 min，之后加入5×逆转录酶缓冲液4 μl，加入RNA酶抑制剂以及逆转录酶1 μl，保证20 μl的总体积。之后设定反应条件为40℃，反应时间设置为1 h，并在70℃下反应10 min，得到cDNA产物，并将产物放在-20℃的冰箱中保存[5]。
1.2.4 检测miR-92水平 配置反应体系，取1 μl cDNA模板，miR-92的特异性前向引物、通用反向引物各 1 μl，2×SYBR Green Master Mix， 最后添加无菌蒸馏水，使总体积达到20 μl。将反应条件设置为95℃，反应时间 5 min，之后在 9、57、72℃下各反应 30 s（循环此操作40次），同时U6作为对照[6]。将每例标本实施复孔检测，共重复检测2次，对每个反应管中的荧光信号到达预定阈值时经历的循环数进行详细记录，并作为Ct值，再次对Ct值进行检测，所取平均值即为样本的Ct值，同时将U6 snRNA作为内参，对Ct值进行检测，并对样本miRNA水平利用2-△Ct法进行计算，其中△Ct=CtmiR-CtU6[7]。
1.3 观察指标
记录对比三组组织标本中的miR-92水平，分析miR-92水平与淋巴结转移、临床分期以及肿瘤分化程度等病理类型之间的关系。
1.4 统计学方法
采用统计学软件SPSS 22.0分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用 t检验，计数资料以率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三组标本组织中miR-92水平的比较
卵巢癌组的miR-92表达水平为（0.645±0.550），高于良性卵巢肿瘤组的（0.491±0.025），差异有统计学意义（t=4.810，P=0.001）；正常卵巢组的 miR-92 表达水平（0.384±0.016）低于卵巢癌组，差异有统计学意义（t=8.157，P=0.001）；正常卵巢组的miR-92表达水平低于良性卵巢肿瘤组，差异有统计学意义（t=6.439，P=0.001）。
2.2 卵巢癌组患者miR-92表达水平与临床病理特征的关系分析
临床分期为Ⅲ+Ⅳ期的miR-92表达水平高于Ⅰ+Ⅱ期，中、高分化水平高于低分化，淋巴结转移患者的miR-92水平高于未转移者，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表2）。
表2 卵巢癌组患者miR-92表达水平与临床病理特征的关系分析（±s）

3 讨论
上皮性卵巢癌是较为常见的妇科恶性肿瘤，由于其缺乏特异性的诊断指标，患者病情确诊时，多数已经发展至晚期，导致上皮性卵巢癌患者的死亡率较高[8]。虽然近年来医疗技术水平不断得到提高，通过采用手术以及其他治疗方法，可使患者5年生存率得到相应提高，但是仍然处于较低水平，所以选择特异性的诊断指标，提高临床诊断准确率对改善患者预后有着重要意义[9-10]。
目前糖链抗原是诊断上皮性卵巢癌的常用标志物，但是在临床应用中发现，此标志物对于诊断上皮性卵巢癌的特异性和敏感性不够优良，所以选择新的肿瘤标志物对改善患者预后具有积极意义[11-12]。miRNA是一种内源性非编码RNA，相关研究显示，在肿瘤产生和发展过程中，miRNA具有重要的调节作用，通过调控靶基因表达，其对细胞的生长、繁殖以及凋亡造成影响，所以miRNA表达与癌症的产生、病理分期以及分化转移存在较大关联[13-15]。本研究利用实时荧光定量检测法对三组组织样本中的miR-92表达水平进行检测，发现卵巢癌组的miR-92表达水平远高于正常卵巢组以及良性肿瘤组，提示利用miR-92表达水平能够良好地对疾病类型实施判断。通过进一步对miR-92表达水平与临床病理特征之间的关系进行分析，研究结果提示，临床分期为Ⅲ+Ⅳ期的miR-92水平高于Ⅰ+Ⅱ期，中、高分化水平高于低分化，淋巴结转移患者的miR-92水平高于未转移者，提示miR-92可参与癌细胞的增殖、转移，并且上皮性卵巢癌患者的miR-92表达水平与淋巴结转移、临床分期以及肿瘤分化程度存在较大的关联性。
综上所述，miR-92可作为上皮性卵巢癌诊断的辅助指标，可为临床诊疗提供重要的参考依据和指导方向。
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（收稿日期：2018-05-23
本文编辑：祁海文）