目前，世界范围内使用的流感病毒疫苗以灭活裂解疫苗和减毒活疫苗为主，其中灭活裂解疫苗被更多的国家批准使用。但是，由于流感病毒的宿主范围广、数量多、共生情况复杂，该病毒在进化和传播过程中不断突变，每年都会有不同的流行株出现。因为每年的流行株不同，所以需要每年进行流行病学调查、毒株预测和筛选、以及相应的疫苗生产，其不仅成本高，而且一旦生产不及时、产量不足或者对流行株的预测不准确，则不能满足人群对即将发生流感疫情的防御需求。目前预防流感最有效的措施是接种疫苗，但有2个因素制约了流感疫苗在防控流感大流行中的应用：一是从确定疫苗株到最终获得疫苗的时间；二是疫苗株与流行株之间的抗原匹配度。因此，利用甲型流感病毒的保守抗原，研制对不同亚型间具有交叉保护作用的广谱流感疫苗，成为流感疫苗研究的重要内容[1-3]。本文对基于流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA）的广谱流感疫苗研发进展作一综述。

流感病毒基因组由8个负链的单链RNA片段组成。该8个片段编码10个病毒蛋白，其中8个是病毒粒子的组成成分（HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2 及 PA），另外2个是分子质量最小的RNA片段，编码两个非结构蛋白—NS1和NS2。HA是构成流感病毒包膜纤突的主要成分之一，以三聚体形式存在于包膜表面，是相对分子质量为75 000的典型Ι型糖蛋白，C端在包膜内，N端在包膜外。HA由566个氨基酸组成，其一级结构具有4个结构域：信号肽（前导序列）、胞外域、跨膜域及胞浆域。信号肽位于HA的氨基端，由16个疏水性氨基酸组成，在加工过程中被信号肽酶切除；紧接信号肽的328个氨基酸是HA1部分，C端的221个氨基酸构成HA2；在HA1和HA2之间有1个精氨酸，在加工过程中被切除。经过切割产生的HA1和HA2通过1个二硫键连接形成HA单体。HA2主要由疏水性氨基酸组成，可使HA插入病毒包膜的脂质双层。

HA的三维结构是由3个HA单体通过非共价连接形成的三聚体，呈头茎结构，去污剂处理病毒可分离到完整的HA纤突。球状头部由部分HA1组成，含有受体结合位点和抗原决定簇，茎部由HA2和部分HA1组成。HA的头部主要由β折叠链构成，茎部主要由2条α-螺旋链形成发夹结构。在HA头部和茎部各单体之间都有局部接触，使形成的三聚体更加稳固。HA单体会被宿主细胞内的蛋白酶裂解成HA1和HA2两个亚单位，HA1形成球状头部结构域，是受体结合位点和主要中和抗体识别的抗原决定簇，但具有很高的变异性。而C端HA2茎部锚定在病毒胞膜中，促使病毒胞膜与细胞膜融合以及病毒核衣壳释放，含有高度保守的融合序列。根据HA的抗原性不同，可将甲型流感病毒分为不同的亚型，HA有16个亚型（H1～H16），不同亚型差异大，所以诱导能针对不同亚型的广谱中和抗体是一个很大的挑战。

目前认为一些相对保守的病毒蛋白或者蛋白序列可以诱导出广谱的免疫反应。如血凝素HA2亚基被证实能诱导产生针对多个流感毒株有交叉反应的中和抗体，是设计通用流感疫苗的热点。虽然HA在病毒进化和传播过程中不断突变，但是参与锚定的HA2片段相对保守，具有诱导广泛交叉反应的抗体潜力，是广谱流感疫苗的潜在研究目标。

已构建的含甲型流感病毒HA（全长或片段）抗原的疫苗包括病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）、合成肽、DNA及载体疫苗等。为提高免疫原性和稳定性，研究者常将HA（全长或片段）与载体蛋白，如钥孔戚血蓝素（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、奈外膜蛋白复合物（outer membrane protein complex，OMPC）融合表达或化学偶联后制成疫苗。

利用不具有感染性的VLP生产疫苗是疫苗研制中一种应用前景较好的方法，并且已经在乙型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗中获得成功。VLP的外源表位以有序、阵列方式呈现，可增加抗原的稳定性和免疫原性。

利用基因工程方法将H5HA构建在pET-28a（+）载体上，肌内注射免疫小鼠，然后用H3N2（HK/68）、H1N1（Ca/09）和 HPAI H5N1（Indo/05）流感病毒攻击小鼠，小鼠可以抵抗病毒的攻击而存活[4]。

球状头部域被不同的连接子取代以产生1个无头HA（茎域），然后与流感M1蛋白共表达，并且鉴定了具有肽（GGGGS）4接头的茎结构域以稳定的方式锚定在细胞膜上。免疫电子显微镜显示，GGGGS 4接头稳定地整合到流感VLP的表面。用这些VLP免疫的小鼠表现出增强的全身性抗体应答，研究发现针对流感病毒的高滴度ADCC抗体，这些VLP也诱导了黏膜免疫反应并在鼻和肺洗液中产生抗原特异性IgG和IgA。另外，抗原特异性IgG抗体分泌细胞（ASC）在脾脏和淋巴结中显著增加。该研究的结果表明，无头的HA是开发针对流感病毒通用疫苗的潜在有效靶点[5]。

合成多肽疫苗是一种仅含表位组分的多肽，可通过人工方式按照多肽的氨基酸顺序合成制备。多肽通常与载体蛋白连接，然后加佐剂制成多肽疫苗。研究发现[6-7]，流感病毒HA上有几个主要的中和表位，可以诱导较强的免疫保护作用，如HA92-105、HA127-133、HA183-195、HA317-341。 这些中和表位，都是潜在的开发通用型流感疫苗研究热点。

融合肽是公认的的高度保守区域[6，8]，HA2多肽的氨基末端即为融合肽。当pH值为中性时，HA2多肽的第76～126位区域形成一个较大的α螺旋结构，第56～75位区域形成半环状结构，第33～55位的23个氨基酸残基形成另一个较小的α螺旋结构。当pH值降至5.0～6.0时，HA2多肽的空间构型发生不可逆性改变，第40～105位区域形成1个大的α螺旋结构，并向前推进约10 nm，使得原来藏在HA蛋白三维结构内部的融合肽暴露，并靠近细胞膜。虽然目前对融合过程的机制尚不完全明了，但推测融合肽移位后可插入细胞膜内，进而介导病毒包膜与胞内体膜融合。在大多数甲型流感病毒高度保守的表位上，融合肽形成了一个扩展的、高度暴露的环状结构。

在大多数甲型流感病毒株中，HA2 N端11个氨基酸序列高度保守。该结构域位于HA前体的一个凸环，在受感染宿主细胞的细胞膜上表达。研究针对融合肽或HA2茎部结构域进行了总结，两项研究均表明，免疫含有HA1/HA2结合区域合成肽 （或肽偶联物）的小鼠在受到病毒攻击后，死亡率较低[6,9]。

多肽结合疫苗诱导的抗体在交叉保护中起着非常重要的作用[10]。更重要的是，广谱中和抗体反应是针对融合肽或部分该种融合肽，其能够诱导出的抗体具有中和反应和保护作用，提示其存在着甲型流感病毒类所共有的保守中和表位，这一发现对疫苗的设计和评价有着极其重要的意义[11-12]。采用化学方法修饰的融合肽免疫，其可以诱导出的抗体反应能够中和甲型流感病毒类并且能够完全保护小鼠免受甲型流感病毒致死性的攻毒[7]。因此，进一步的研究可基于融合肽开发通用流感疫苗。

然而，合成多肽疫苗免疫动物后所起的免疫保护作用低于人们的预期，合成肽疫苗的抗原性和免疫原性受到自身组成及宿主免疫系统等多种因素影响，单一的中和表位远不能刺激机体产生足够强的免疫反应，可能还需要增加中和抗原表位的数目，引入抗原表位、佐剂辅助等，因此，如何利用有限的抗原表位来诱导强有力、持续时间长的免疫保护作用需进一步深入研究。

核酸疫苗是将可表达保护性免疫基因的质粒DNA直接导入机体细胞，使抗原蛋白经过内源性表达并提呈给免疫系统，诱发机体产生特异性的免疫作用。

然而，核酸疫苗的研制和开发才刚刚起步，还有很多的关键性问题急待解决。第一，所用载体多带有抗生素基因，导致被免疫机体可能对相应的抗生素产生抗体，给一些常见细菌性疾病的预防和治疗带来困难；第二，目前所研制的核酸疫苗体内表达效率不够高，免疫保护力不强，其可能与核酸疫苗在机体内的生存和表达有关，有可能进入机体的大部分质粒被机体当作异物降解，只有少部分得以残存和表达，或者是载体在动物体内表达效率不高，降低了核酸疫苗的免疫效果。

流感病毒HA的HA2亚基相对于HA1球状头部结构域非常保守。HA2结构域在不同亚型中有高达85%的同源序列和在相同亚型之间的毒株有95%的同源性[13]。然而，在自然感染或接种常规流感疫苗过程中，对于HA2结构域的免疫反应弱，而且也未见相关的报道，可能是由于高免疫原性球状HA1结构域的存在。

一项研究中使用修饰后的核酸疫苗，用化学方法把亚病毒颗粒去除HA1结构域免疫兔子或老鼠诱导针对于HA2的体液反应，但在攻毒试验中，没有提供良好的免疫保护作用[14]。然而，最近的研究表明，成功的疫苗设计诱导HA2免疫，具有球状头部结构域的HA分子在流感病毒攻毒实验中提供良好的免疫保护作用[15]。也有相似的研究报道，识别在中间的茎部结构域HA构象表位的单克隆抗体（C179），可以中和所有的H1和H2亚型[15]。另有报道称，其他单克隆抗体结合的HA茎部结构域经过分离和鉴定，具有广泛交叉反应性中和活性[16-20]。这样一个广泛的中和抗体结构和功能分析表明，其可以通过插入到重链，到1个在茎区的保守部位以阻止感染，从而在病毒进入的过程中，可能阻止膜融合，因此，单克隆抗体能够中和多种亚型的流感病毒[10,12]。

最近的研究表明，用重组疫苗接种和/或转基因修饰的免疫原可以产生针对于保守表位抗体的疫苗。用质粒DNA和重组腺病毒载体疫苗，经初免-加强疫苗接种表达H1，HA诱导抗体识别保守茎部结构域，因此具有广泛的中和活性。用DNA和VLP疫苗的3剂疫苗免疫小鼠提高了流感病毒多个亚型的交叉反应性抗体，该种疫苗含有修饰缺乏的球状头域HA分子，但保持完整的茎部结构域，包括HA1和HA2的部分区域[21]。

具有广泛中和活性的H3亚型单克隆抗体（12D1）可以识别HA2蛋白的α螺旋区域，HA2蛋白对应的氨基酸为76-106[22]。基于12D1抗体的结合位点，设计含氨基酸76-130 HA2的合成肽，偶联到KLH载体蛋白，然后产生抗流感病毒HA蛋白茎部结构域的抗体[22]。该种疫苗对病毒抗原性不同的亚型有保护作用[21]。综上所述，上述研究提供了有力的证据，支持基于相对保守的HA茎部结构域，开发具有广泛保护作用广谱流感疫苗的有效途径。

在过去几十年中，流感疫苗获得较快的发展，从最初的全病毒灭活疫苗到现在的病毒裂解疫苗、亚单位疫苗，进一步保证了疫苗的安全性。随着新技术的发展以及对流感病毒研究的深入，广谱或通用流感疫苗的研究为“一劳永逸”而非频繁更换生产用毒株来生产流感疫苗带来了希望。

目前广谱流感疫苗的研究目标主要集中在流感病毒M2蛋白高度保守的胞外结构域或NP、M1和HA蛋白的保守抗原表位，并且已在研究中获得了很好的动物试验数据，其均为开发具有诱导广泛交叉保护疫苗的发展提供了有力证据。美国佐治亚大学与法国赛诺菲巴斯德公司合作，开发出了一种基于HA对多种毒株的甲型H1N1流感病毒都具有防护作用的流感疫苗。COBRA流感疫苗设计为可识别出过去100年内曾分离出的所有H1N1型流感病毒毒株。实验中疫苗还对H1N1流感病毒以外的其他类型流感病毒产生了免疫应答，目前正处于临床前研究阶段。葛兰素史克基于嵌合HA蛋白的通用流感疫苗进入临床 1 期试验[23-24]。 Multimeric-001（M-001）是以色列的Biond Vax公司开发的一种候选通用流感疫苗，该疫苗最初是由以色列魏兹曼科学研究所、以色列科学与人文科学学院前院长Ruth Arnon教授团队设计，主要是将来自于流感病毒HA、NP与M蛋白的9个保守线性表位串联后通过大肠杆菌系统融合表达后纯化制备，并将在2018/19流感季之前正式开展其候选通用流感疫苗M-001的Ⅲ期临床试验，该疫苗是第1个挺进Ⅲ期临床试验的通用流感疫苗[25-27]。但是否真的可以通过1次或多次“广谱流感疫苗”的免疫，使人体获得对流感病毒株的广谱有效保护，还需更多的临床试验数据来验证和支持。

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