神经生长因子及其低亲和力受体诱导肝星状细胞凋亡的初步研究
朱海燕 吴雄健 曾 斌 谢志军
赣南医学院第一附属医院消化内科，江西赣州 341000
[摘要]目的 观察神经生长因子（NGF）及其低亲和力受体（p75NTR）对大鼠肝星状细胞（HSC）凋亡及增殖的影响以及大鼠HSC中相关凋亡蛋白变化，探索NGF影响HSC凋亡的可能作用机制。方法 体外培养大鼠肝星状细胞（HSC-T6），将HSC-T6与不同浓度的NGF及NGF＋P75NTR孵育，分为对照组、NGF组和NGF＋P75NTR组，对照组采用 0 ng/ml NGF＋0 ng/ml p75NTR，NGF 组采用 100 ng/ml NGF，NGF＋p75NTR 组采用 100 ng/ml NGF＋100 ng/ml p75NTR，应用流式细胞术对HSC凋亡情况进行检测，通过XTT法了解NGF及p75NTR对HSC增殖的影响；采用免疫细胞化学法观察NGF及p75NTR对HSC作用后P53、Caspase-3表达的变化。结果NGF组对HSC的增殖抑制与NGF＋p75NTR组及对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。流式细胞术检测结果显示，对照组的凋亡率低于NGF组和NGF＋P75NTR组， 差异有统计学意义 （P＜0.05），NGF＋p75NTR组较NGF组凋亡率明显升高 （P＜0.05）。NGF组和NGF＋P75NTR组的 P53、Caspase-3表达与对照组比较明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），其中NGF＋p75NTR组升高较NGF组明显（P＜0.05）。结论 NGF可能通过p75NTR抑制HSC-T6增殖、促进其凋亡，其机制可能与调节P53、Caspase-3表达有关。
[关键词]肝星状细胞；凋亡；神经生长因子；神经生长因子低亲和力受体
[中图分类号]R332
[文献标识码]A
[文章编号]1674-4721（2018）10（b）-0008-04
[基金项目]江西省卫生计生委科技计划项目（20175347）；江西省教育厅科学技术研究项目（GJJ170859）
The preliminary study on the apoptosis of hepatic stellate cells induced by nerve growth factor and its low affinity receptor
ZHU Hai-yan WU Xiong-jian ZENG Bin XIE Zhi-jun
Department of Gastroenterology,the Frist Affiliated Hospital of Gannan Medical University,Jiangxi Province,Ganzhou 341000,China
[Abstract]Objective To observe the effect of nerve growth factor(NGF）and its low affinity receptor(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)on the apoptosis and proliferation of rat hepatic stellate cells (HSC),and to explore the possible mechanism of apoptosis.Methods Rat hepatic stellate cells(HSC-T6)were incubated in vitro,HSC-T6 was incubated with NGF and NGF＋p75NTR with different concentrations.The cells were divided into the control group,the NGF group and the NGF＋p75NTR group.The control group was cultured with 0 ng/ml NGF＋0 ng/ml p75NTR,the NGF group was cultured with 100 ng/ml NGF,and the NGF＋p75NTR group was cultured with 100 ng/ml NGF＋100 ng/ml p75NTR.The flow cytometry was used to detect the apoptosis condition.The effect of HSC on the proliferation of NGF and p75NTR was observed by XTT,the expression of P53 and Caspase-3 were detected by immunohistochemical staining.Results The inhibitory effect of the NGF group on the proliferation of HSC was statistically significant(P＜0.05)with the NGF＋p75NTR group and the control group (P＜0.05).The flow cytometry results showed that the apoptosis rate of the control group was lower than that of the NGF group and the NGF＋p75NTR group(P＜0.05),the apoptosis rate of the NGF＋p75NTR group was higher than the NGF group(P＜0.05).The expression of P53 and Caspase-3 in the NGF group and the NGF＋p75NTR group were significantly higher than that in the control group (P＜0.05),the expressions in the NGF＋p75NTR group were significantly higher than that in the NGF group(P＜0.05).Conclusion NGF may inhibit HSC-T6 proliferation and promote its apoptosis through p75NTR,which may be related to the regulation of P53 and Caspase-3 expression.
[Key words]Hepatic stellate cells;Apoptosis;Nerve growth factor;Nerve growth factor low affinity receptor
肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化是慢性肝病进展的中心环节[1-2]，人及大鼠的HSC都可表达低亲和力受体（p75 neurotrophin receptor，p75NTR），当神经生长因子（nerve growth factor，NGF）与p75NTR结合时可诱导细胞凋亡[3]。本研究主要探讨NGF及p75NTR影响HSC增殖及凋亡的可能作用机制，寻找防治肝纤维化的新途径。
1 材料与方法
1.1 材料
NGF及p75NTR购自美国RD公司；AnnexinⅤ-FITC购自美国罗氏公司；P53 and Caspase-3抗体购自武汉博士德公司；S-P超敏试剂盒（鼠/兔）及DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司；DMEM培养液及胎牛血清购至美国Gibco公司。HSC系HSC-T6由上海中医药大学徐列明教授提供，系SV40转染后的大鼠HSC，具有活化HSC表型。
1.2 方法
1.2.1 HSC-T6的培养与传代 使用DMEM培养液（含100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素，10%胎牛血清）进行培养。设定培养温度37℃，CO2浓度5%，湿度饱和。于隔天进行一次换液。待细胞密度达80%～90%，以0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶分散细胞，按1∶4传代。将其分为对照组、NGF组和NGF+p75NTR组，对照组采用0 ng/ml NGF+0 ng/ml p75NTR，NGF组采用100 ng/ml NGF，NGF+p75NTR 组 采 用 100 ng/ml NGF+100 ng/ml p75NTR。
1.2.2 NGF及p75NTR对HSC-T6增殖的作用 取对数生长期细胞，细胞悬浮液浓度调至7×104/ml，接种于96孔板中，每孔200 μl，24 h后弃上清，加入各浓度NGF，三组各设4个复孔，培养24 h，而后将预配的XTT比色液50 μl分别加入各孔，置于培养箱中再孵育4 h。使用酶标仪测定吸光值（OD值），设定主波长570 nm，参考波长690 nm。
1.2.3 NGF及P75NTR对HSC-T6凋亡的影响 取对数生长期细胞，细胞悬液浓度调至5×105/ml，接种于T-25培养瓶中，24 h后按照分组各培养24 h，收取所有细胞，取1×106洗涤细胞，加入100 μl的结合缓冲液，再加AnnexinⅤ-FITC染液和碘化丙啶（PI）染液各2 μl，在室温下避光染色30 min，然后再添加结合缓冲液300 μl，以流式细胞仪检测HSC凋亡。
1.2.4 P53及Caspase-3表达的测定 取对数生长期细胞，细胞悬液浓度调配至7×104/ml，滴于预先处理好的置于六孔板内的盖玻片上，每孔0.4 ml，孵育24 h，分组后继续培养24 h，然后以4%多聚甲醛固定细胞，分别使用P53及Caspase-3一抗，应用SP法进行免疫细胞化学染色，DAB显色，苏木精复染，二甲苯透明，中性树脂封片，在光学显微镜下胞膜或胞浆或胞核呈棕黄色的为阳性细胞。每张切片在400×光镜视野下共取10个视野，计数各自阳性细胞所占比例。以各阳性细胞的百分数来表示相应蛋白的阳性表达率。
1.3 统计学方法
采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组数据间的比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组细胞增殖情况比较
各组与HSC-T6作用24h后，对照组OD值为0.73±0.01，高于NGF组的0.65±0.03及NGF+p75NTR组的0.40±0.04，差异有统计学意义（P＜0.05）；NGF 组与NGF+p75NTR组对HSC的增殖抑制作用比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.2 各组细胞凋亡情况比较
各组与HSC-T6作用24 h后，流式细胞术检测结果显示，对照组凋亡率[（6.88±1.35）%]低于 NGF 组和 NGF+p75NTR 组，差异有统计学意义（P＜0.05）；NGF+p75NTR 组的凋亡率为（37.69±2.30）%，较 NGF 组凋亡率[（26.36±8.51）%]明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）（图 1）。

 
图1 NGF及p75NTR诱导肝星状细胞凋亡的流式细胞术观察
2.3 P53及Caspase-3蛋白的表达的变化
各组与HSC-T6作用24 h后，NGF组和NGF+p75NTR组的P53、Caspase-3表达与对照组比较有明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），其中NGF+p75NTR组升高较NGF组明显，差异 有统计学意义（P＜0.05）（表1，图 2～图 4）。
表1 NGF及p75NTR处理HSC后Caspase-3、P53表达阳性细胞率的比较（%）

 
与对照组比较，*P＜0.05；与 NGF 组比较，#P＜0.05

 
图2 P53细胞免疫化学染色结果（S-P法，400×）

 
图3 Caspase-3细胞免疫化学染色结果（S-P法，400×）

 
图4 空白对照组（S-P法，400×）
3 讨论
肝纤维化是肝硬化的早期病理改变和必经阶段，是由各种致病因素导致肝脏慢性损伤。目前的研究结果认为，各种致病因素损伤肝细胞后，Kupffer细胞被激活，分泌出多种细胞因子，共同作用于HSC，最终导致肝纤维化[4-6]。HSC的活化和增殖是肝纤维化发生、发展进程中的一个关键环节。活化HSC已成为防治肝纤维化的主要靶细胞之一，诱导活化HSC凋亡是防治肝纤维化的一个重要策略[7-9]。
NGF不仅可诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化，还可阻断四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化，减轻肝组织炎症 [10-11]，NGF需通过p75NTR介导才可诱导细胞凋亡[12]。p75NTR介导的凋亡机制与多种细胞因子、激酶有关，其中丝裂原相关的蛋白激酶（MAPK）、半胱天冬酶（Caspase）等作用重要。研究发现肝脏受损的情况下肝细胞可表达NGF，用重组体NGF培养HSC，细胞凋亡明显增多，且具有剂量依赖性，该作用可能通过调节NF-κB活性及PI3K/AKT信号通路而实现[13-15]。Caspase-3是多种凋亡途径的共同下游效应分子，常被作为研究细胞凋亡的关键分子[16]。在P53缺乏时，肝损伤产生更少的衰老细胞，并相应增加了HSCs的激活、细胞外基质沉积和间质纤维化[17]。作者前期研究结果也显示，经NGF作用的大鼠HSC，可抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡及抑制HSC合成Ⅰ、Ⅲ型胶原[18-19]。NGF诱导细胞凋亡可能与使凋亡相关基因Caspase-3、P53表达上调，Bcl-2表达下调有关[20]。NGF联合p75NTR的作用特点为针对不同靶细胞可能分别或共同发挥两种相反的作用，诱导凋亡或促进存活。在既往研究中，多为分别观察HSC中NGF或p75NTR的表达改变，有关研究结果甚至有相互矛盾之处，多认为NGF或p75NTR对HSC具有诱导凋亡的作用。本研究在既往研究基础上，加入p75NTR及NGF共同作用于HSC，结果显示NGF＋p75NTR组相较单纯NGF组对HSC的增殖抑制及诱导凋亡作用更加明显，可进一步增加凋亡相关蛋白Caspase-3、P53的表达，提示NGF与其p75NTR对于HSC的增殖抑制及诱导凋亡具有协同作用，NGF可能通过p75NTR从而诱导HSC凋亡及抑制其增殖，机制可能与调节Caspase-3、P53的表达有关。
目前关于NGF如何诱导HSC凋亡机制研究较少，本研究结果希望对今后进一步研究NGF作用于HSC的相关分子机制提供前期实验基础，为防治肝硬化及肝纤维化提供新的路径。
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（收稿日期：2018-06-22
本文编辑：祁海文）