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短暂性脑缺血（TIA）发作又称小中风，为急性脑梗死先兆[1]。TIA发作尽管持续时间短，但仍具有一定脑损害，研究发现存在细胞毒性水肿。有研究表明，针刺对TIA发作有一定疗效，但机制不明[2-3]。细胞凋亡（apoptosis）又称细胞程序性死亡，是TIA发作脑损伤的一种方式。腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，有一定的脑保护作用[4]。目前治疗TIA发作，预防缺血脑卒中主要为口服抗血小板药物，但这些药物有的患者不能够耐受，针灸自古以来就用来预防疾病，又称“针灸治未病”，用来预防中风[5]。本研究利用全脑缺血TIA动物模型，探讨针刺对TIA发作模型大鼠神经元凋亡、腺苷水平的影响，为针刺治疗TIA发作，预防进展为脑梗死提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

雄性SD大鼠购自大连医科大学实验动物中心（合格证编号为 SY（辽）2014101），SPF 级，体重（240±30）g，随机分为4组，每组8只，分别为正常对照组、假手术组、模型组、针刺组，实验处置提交动物伦理委员会，符合小动物伦理标准。

1.2 主要仪器及试剂

一次性无菌针灸针（苏州顺通医疗器械有限公司，批号：20150820），KWD-808Ⅱ型脉冲电疗仪（武进长城医疗器械有限公司，批号：20140232）；原位末端凋亡检测试剂盒（北京嘉美纽诺生物科技有限，批号：20140507）。

1.3 模型制作方法

参考李军杰等[6]方法建立TIA大鼠模型。

1.4 实验各组干预方法

正常对照组不给任何干预。假手术组：只进行模型组手术操作步骤，不发生缺血。模型组：按模型制作方法造模。针刺组：造模后24 h后给予针刺治疗。取穴百会，曲池（双侧），足三里（双侧）。双侧“足三里”“曲池”穴连接电疗仪，频率1 Hz，电压2 V，针刺1次/d，时间30 min，治疗7 d断头取脑。

1.5 实验取材

一侧大脑置于冰台上，分离出皮层与海马，立即放入液氮中冻存，整个过程在0℃条件下进行，时间控制在2 min内。另一侧大脑迅速放入-80℃冻存，用切刀前额极向后至枕极平分为5等份，取含有海马、皮质脑片。

1.6 TUNEL法检测细胞凋亡

将冰冻组织切片置10%中性甲醛中固定，切片上滴加54 μl TdT酶反应液，置湿盒中于37℃反应1 h，滴加过氧化物酶标记的抗体，DAB显色，复染，用二甲苯脱水，封片、干燥，在光学显微镜下观察并记录实验结果.显微镜组成的图像处理系统上，测定每组每只大鼠大脑皮质、海马CA1区凋亡阳性细胞密度（个/mm2）。

1.7 腺苷测定

从液氮中取出大脑皮质与海马组织，称重，制备成脑组织匀浆，离心吸取上清液用5 mol/L K2CO3溶液中和呈pH 7.4于2℃，14 000 r/min离心25 min，吸取上清液，加入1/2体积含3 mmol/L K2HPO4及3 mmol/L EDTA的Tris-HCl缓冲液，摇匀，分光光度计测定，得到吸光值变化（△E292）的曲线，根据标准曲线即可测出脑组织腺苷的含量（μmol/L mg）。

1.8 统计学方法

使用SPSS 20.0软件包进行统计分析，所有数据均以均数±标准差（

±s）表示，采用多因素方差分析，两两比较采用LSD检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组凋亡阳性细胞数的比较

模型组CA1区、大脑皮质凋亡阳性细胞数高于针刺组，差异有统计学意义（P＜0.05）。正常对照组、假手术组均低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 1）。

表1 四组凋亡阳性细胞数的比较（个/mm2）

与针刺组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

2.2 四组脑组织腺苷含量的比较

模型组CA1区、大脑皮质腺苷含量低于针刺组，差异有统计学意义（P＜0.05）。正常对照组、假手术组均低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 四组脑组织腺苷含量的比较（μmol/L，

±s）

与针刺组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

3 讨论

TIA与中医的“小中风”相似。主要病机为气虚血瘀，肝阳上亢，痰湿阻络，脑络瘀阻[7]。现代医学认为主要与高血压病，糖尿病，高脂血症，肥胖等因素致脑动脉硬化有关。TIA有1/3进展为脑梗死。“针灸治未病”古来有之，是中医基础理论主要的组成部分，早在《内经》就有强调预防疾病的观点[8]。高武在《针灸聚英》中称此为“逆针灸”[9]。就是在发病前给予针灸，而预防疾病发生。中医认为针灸可以激发经络之气，扶助正气，祛除邪气[10]。正气存内，邪不可干，可提高机体抵御各种致病因子的能力，可用于预防中风、感冒、提高机体免疫力等，从而达到防止疾病的发生、发展，保健延年的目的[11]。但作用机制尚不明，本研究将进一步深入探讨。

本研究选取百会穴位于头顶正中线与两耳尖连线的交叉处，穴居巅顶，贯达全身，联系脑部，是调节大脑功能的要穴。头为诸阳之会，百脉之宗，而百会穴则为各经脉气会聚之处。曲池属于手阳明大肠经之合穴，出自《灵枢·本输》。此腧穴在肘横纹外侧端，有清热解表、疏经通络的作用；足三里穴，是“足阳明胃经”的主要穴位之一，位于小腿外侧，具有调理脾胃功效，治下肢痿痹。《灵枢》邪在脾胃，则病肌肉痛，足三里有强壮作用，为保健要穴[12]。这是本研究选取穴位的依据。

TIA反复多次缺血可诱发细胞凋亡，是因为缺血诱发了凋亡相关基因的突变，致局部神经元发生凋亡。本实验观察各组大脑皮质、海马CA1区神经元凋亡，模型组可见较多凋亡阳性细胞，提示TIA可诱发细胞凋亡，而正常对照组、假手术组凋亡阳性细胞少许。针刺组较模型组凋亡阳性细胞明显减少，提示针刺可抑制神经元凋亡，可能是针刺发挥脑保护作用途径之一，其机制可能涉及凋亡相关性基因表达[13-14]，有待进一步探讨。

腺苷是机体在缺血缺氧时高能磷酸盐分解产生的一种内源性核苷。脑缺血细胞外液腺苷含量增高，为机体保护性反应，有一定脑保护作用[15]。假手术组与正常对照组脑组织腺苷含量差异无统计学意义（P＞0.05），模型组脑组织腺苷含量高于假手术组、正常对照组，提示脑缺血后，可诱发内源性腺苷含量增高，可能为机体的保护机制，针刺组较模型组腺苷含量明显增高。本实验结果提示，针刺可使缺血脑组织腺苷含量增高，针刺脑保护机制与腺苷有着极为密切关系，增强内源性腺苷含量很可能是针刺脑保护作用机制之一。

[参考文献]

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[13]李军杰，张致身.短暂性脑缺血发作后海马区星形胶质细胞形态学研究[J].首都医科大学学报，1998，19（4）：323-326.

[14]郭森，魏萌，杨松鹤.针刺对慢性脑缺血大鼠三叉神经脊束核神经元钙通道Cav1.3表达及凋亡的影响[J].承德医学院学报，2018，35（2）：96-98.

[15]唐伟，邹飒枫.针刺预处理对脑缺血/再灌注大鼠脑水肿及腺苷水平的影响[J].中国中西医结合急救杂志，2007，14（3）：166-168.